根莖類中藥材有機(jī)氯及菊酯類農(nóng)藥多殘留分析

黃曉會(huì)， 薛 健， 吳曉波， 佟鶴芳， 薛 雯， 龐作正

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京100193;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，寧夏銀川750004)

中藥材作為中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的一部分，在治病救人方面發(fā)揮著重要作用，特別是近年來，人們越來越傾向于回歸自然，選擇毒副作用較小的中成藥作為治療各種疾病的首要手段，同時(shí)隨著中國醫(yī)療水平的提高，人們在醫(yī)藥方面的需求不斷增加，中藥材資源供應(yīng)愈顯不足，所以現(xiàn)在的大部分中藥材都依賴于人工栽培。為了提高產(chǎn)量，防治病蟲害，種植者頻繁的使用各種農(nóng)藥，由于他們?nèi)狈?duì)農(nóng)藥本身的性質(zhì)、農(nóng)藥對(duì)中草藥的作用機(jī)制、農(nóng)藥殘留特性和規(guī)律以及農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響等方面的認(rèn)識(shí)，往往造成中草藥中農(nóng)藥殘留污染。根莖類藥用植物多為多年生草本植物，如丹參、地黃、板藍(lán)根、黃芪等藥材，由于生長時(shí)間長，更容易使農(nóng)藥蓄積，致使農(nóng)藥殘留超標(biāo)。農(nóng)藥殘留超標(biāo)不僅危害到人類的身體健康，還關(guān)系到我國名貴藥材的出口創(chuàng)匯。20世紀(jì)80年代末云南省出口日本的三七被大量退貨，目前我國在海外市場又日益受韓國高麗參的排擠，中藥材進(jìn)口國的技術(shù)壁壘，限制了我國中藥材出口［1］，這在某種程度上影響了我國這一天然藥物大國的形象。

有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥均是廣譜殺蟲劑，廣泛用于殺滅農(nóng)業(yè)害蟲，曾是各國殺蟲劑使用最廣泛的農(nóng)藥。有機(jī)氯農(nóng)藥因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，脂溶性大，殘留期長，殘留量高，易在脂肪中蓄積，擬除蟲菊酯類使用后的毒副作用越來越明顯，均可造成慢性中毒，嚴(yán)重危及人體健康［1］。世界各國已在20世紀(jì)70年代末禁止使用，但是目前仍然在土壤［2］，農(nóng)產(chǎn)品［3］，中藥材［4-5］中檢測出來，而藥材的種植期長，尤其是多年生的根類藥材，易受其農(nóng)藥的污染［6］。目前中藥中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的檢測方法已經(jīng)收入2010年版中國藥典附錄，但僅限于檢測甘草、黃芪等幾種中藥中的六六六四個(gè)異構(gòu)體、滴滴涕四個(gè)異構(gòu)體和五氯硝基苯共9種有機(jī)氯農(nóng)藥［7］，這與我國500種常用藥材的數(shù)量相比還有較大距離，也不能滿足國內(nèi)外對(duì)農(nóng)藥殘留檢測愈加嚴(yán)格的要求。因此，針對(duì)各種中藥樣品國內(nèi)應(yīng)該盡快進(jìn)行更多種類的有機(jī)氯農(nóng)藥多殘留分析方法學(xué)的摸索研究，以盡快建立一套適合于多種類中藥的比較通用的有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥多殘留分析方法，以提高中草藥在國際市場上的競爭力。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-7890氣相色譜儀;Agilent電子捕獲檢測器(ECD);Agilent-G4513A自動(dòng)進(jìn)樣器;Agilent-DB1701(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)與 Agilent-HP-5(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱;JSP-750A高速萬能粉碎機(jī)(浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠);PL203/01電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);T-150超聲波清洗器(北京天鵬有限公司);LABORATA-4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph);SHB-B型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)等。

1.2 藥品與試劑 甘草、浙貝母、白芨、牛膝、天麻(購于安國藥市)。正己烷(色譜純 Fisher公司)，乙酸乙酯、無水硫酸鈉、正己烷(分析純北京化工廠)，乙腈(分析純，北京化工廠)，F(xiàn)lorisil硅土柱(1000 mg/6 mL，美國Agilent公司)，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司，美國 Chem Service公司，德國Riedel-deHaen公司，美國Accustandard公司，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)，純度均在99.0%以上，詳細(xì)信息見表1。

表1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品信息Tab.1 Standard of pesticides

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取條件的選擇 通過參考相關(guān)有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留測定的方法，農(nóng)藥殘留常用的提取方式有振蕩法，索氏提取法，微波輔助提取法等［3］。考慮到實(shí)驗(yàn)室可行條件及此方法適合推廣的要求，本實(shí)驗(yàn)采取了有機(jī)溶劑超聲，然后過濾的提取方式。

通過對(duì)文獻(xiàn)［8-10］的調(diào)查及農(nóng)藥的溶解性等各方面的因素，初步選擇乙腈、正己烷、正己烷-丙酮(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)四種溶劑作為本次提取條件選擇的溶劑種類?？紤]到提取時(shí)間以及提取溶劑量對(duì)提取結(jié)果的影響，因此對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、提取溶劑的體積三種因素進(jìn)行優(yōu)化選擇。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案見表2。

表2 50種農(nóng)藥多殘留氣相測定提取方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案表Tab.2 Orthogonal program of extraction

精確稱取2.0 g甘草藥材共5份(其中3份平行，同時(shí)做空白和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1份)，加入500 μL質(zhì)量濃度為400 μg/L農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻過夜。按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)冰浴超聲提取后，再按照2.2項(xiàng)確定的凈化條件凈化，按2.3項(xiàng)測定樣品，根據(jù)所得峰面積計(jì)算各實(shí)驗(yàn)的回收率，比較得出甘草藥材經(jīng)30 mL乙腈超聲提取25 min后，提取的雜質(zhì)較少，提取的農(nóng)藥的平均回收率在85.3%，各農(nóng)藥的回收率基本都在這一水平左右，除了pp'-DDD為71.5%、氟胺氰菊酯為73.6%以外，其他都在77.8% ～115.3%之間，而其他的提取系統(tǒng)都有較多不符合農(nóng)殘測定回收率在75%～125%之間的要求。

提取條件:精密稱取2.0 g樣品，置于100 mL錐形瓶中，加入2.0 g無水硫酸鈉混勻加入乙腈溶劑30 mL，混勻。冰浴超聲提取25 min，過濾。剩余的濾渣入濾紙中，用10 mL乙腈分多次沖洗錐形瓶再淋洗濾渣，合并濾液，于40℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL正己烷溶解，

2.2 凈化條件的選擇 分析試樣中農(nóng)藥品種的不同以及采用不同的檢測器，對(duì)凈化的要求也有所不同。當(dāng)分析有機(jī)氯農(nóng)藥時(shí)，通常采用電子捕獲檢測器，由于該檢測器中放射源易受污染，所以對(duì)凈化要求嚴(yán)格。

根據(jù)文獻(xiàn)［11-13］有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥多殘留測定樣品處理的凈化柱種類一般為Florisil SPE柱、石墨化碳/氨基 SPE柱、C18SPE柱、中草藥專用柱(TPH)。一般選用的正己烷-丙酮(9∶10)、正己烷-乙酸乙酯(95∶5)、正己烷-乙酸乙酯(85∶15)、而對(duì)于C18SPE柱對(duì)農(nóng)藥殘留的洗脫一般用乙腈溶劑，石墨化碳/氨基SPE柱選用乙腈-甲苯(3∶1)。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案見表3。

表3 50種農(nóng)藥多殘留氣相測定凈化方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案表Tab.3 Orthogonal program of purification

精確稱量2.0 g甘草藥材共5份(其中3份平行，同時(shí)做空白和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1份)，加入500 μL質(zhì)量濃度為400 μg/L農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻過夜。按照2.1項(xiàng)的提取方法處理后，濃縮樣品加入用洗脫劑預(yù)淋洗后的SPE柱上，樣品瓶用洗脫劑少量多次清洗后上柱，接取所有洗脫液后，在40℃下水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，加入1 mL正己烷，按2.3項(xiàng)下的色譜條件測定樣品，根據(jù)所得峰面積計(jì)算各實(shí)驗(yàn)的回收率，TPH正己烷-丙酮(9∶1)、Carb-NH2乙腈-甲苯(3∶1)、C18乙腈的總體平均回收率在75.4% ～82.4%之間，且各有較多的回收率不符合要求，用Florisil凈化的總體平均回收率在91.7%～97.9%，符合農(nóng)殘測定的要求。Florisil SPE柱3個(gè)淋洗劑的凈化效果基本相似，沒有非常大的區(qū)別，相對(duì)而言從整個(gè)基線，以及5～20 min這一區(qū)間，以正己烷-乙酸乙酯(85∶15)＞正己烷-乙酸乙酯(95∶5)＞正己烷-丙酮(9∶1)。因此本實(shí)驗(yàn)采用Florisil SPE柱為凈化柱，正己烷-乙酸乙酯(85∶15)為洗脫劑的凈化系統(tǒng)。

凈化條件:將Florisil柱置于固定架上，加1 cm左右高度的無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-乙酸乙酯(85∶15)的淋洗液進(jìn)行淋洗，在淋洗液近干時(shí)快速移入樣品濃縮液，用50 mL的茄型瓶接收淋出液，用2 mL的淋洗液多次充分的洗脫茄型瓶并轉(zhuǎn)入柱中，收集洗脫液20 mL，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。加入1 mL正己烷溶解，作為樣品溶液備用。

2.3 色譜條件的選擇 參考國際通用的方法，采用2根不同極性的毛細(xì)管柱，如果2根不同極性的毛細(xì)管柱上同時(shí)可檢測出某種農(nóng)藥，則可判定該樣品中含有此有機(jī)氯農(nóng)藥，選用屬于低極性的HP-5柱和屬于中等極性的DB1701柱，經(jīng)進(jìn)樣口、檢測器、柱箱溫度以及載氣流量等試驗(yàn)，建立的色譜條件可以使50種有機(jī)氯農(nóng)藥得到較好的分離。圖1為50種有機(jī)氯及菊酯類農(nóng)藥在HP-5柱上的出峰順序，圖2為其在DB1701柱上的出峰順序，可以看出在改變柱子的極性后，農(nóng)藥的出峰時(shí)間和出峰順序也發(fā)生改變，這樣通過雙柱比對(duì)做到互相補(bǔ)充可以幫助排除可能出現(xiàn)假陽性問題。

圖1 50種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥用HP-5柱的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 50 organchlorine and pyrethroid pesticides by HP-5 capillary column

圖2 50種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥用DB1701柱的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 50 organchlorine and pyrethroid pesticides by DB1701 capillary column

色譜條件:彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)HP-5 與 DB1701 雙柱定性，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣;升溫程序?yàn)槌跏紲囟?20℃保持1 min，以8℃/min的速度升溫至150℃保持2 min，以4℃/min的速度升溫至270℃保持14 min，再以10℃/min的升溫速度升溫至290℃，保持10 min;檢測器溫度300℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量 1 μL。

3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別配制出10、40、80、200、400 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 2.3 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行GC-ECD測定。以峰面積進(jìn)行回歸計(jì)算，得相應(yīng)農(nóng)藥的回歸方程，農(nóng)藥在10～400 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r2均大于0.9910。

3.2 儀器的精密度與靈敏度 取100 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測得各農(nóng)藥的RSD值在0.6% ～4.9%之間，說明儀器精密度良好。根據(jù)各農(nóng)藥的信噪比，計(jì)算各農(nóng)藥的檢出線(LOD)2.51～6.86 μg/L。

3.3 加樣回收率與檢測限 按所確定方法對(duì)5種藥材分別做回收率實(shí)驗(yàn)。具體做法:取供試品，粉碎，過藥典2號(hào)篩，取約2.0 g，一式9份，分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使已知含有量的樣品中農(nóng)藥質(zhì)量濃度增加20，80，160 μg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品3份，按以上優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法處理并測定，計(jì)算相應(yīng)回收率及RSD值。同時(shí)以最低質(zhì)量濃度加樣中噪音的3倍計(jì)算每種農(nóng)藥的檢出限，以10倍噪音計(jì)算定量限。50種農(nóng)藥的回收率分別為69.1% ～ 108.3%(甘草樣品)、65.5% ～ 110.4%(浙貝母樣品)、69.8% ～ 107.9%(白芨樣品)、65.6% ～ 111.3%(牛膝樣品)、63.9% ～ 113.0%(天麻樣品)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于18%，檢測限大多低于10 μg/kg，定量限大多低于 35 μg/kg(以牛膝樣品為例)符合農(nóng)藥殘留痕量測定要求。

3.4 重復(fù)性 精密稱定樣品(防己樣品)9份，按2項(xiàng)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件制備的樣品并進(jìn)行測定，計(jì)算各農(nóng)藥的RSD均在2.51% ～8.15%之間，方法的重復(fù)性良好。

4 實(shí)際的樣品測定

稱取以上5種藥材各6個(gè)批次，按照2項(xiàng)制備樣品并進(jìn)氣相測定，外標(biāo)法定量，1號(hào)甘草檢出六氯苯 0.002 μg/g，西瑪津 0.012 μg/g，氯硝銨 0.002 μg/g;2號(hào)甘草檢出四氯硝基苯0.078 μg/g，六氯苯0.012 μg/g，溴氰菊酯 0.034 μg/g;3 號(hào)浙貝母檢出六氯苯 0.001 μg/g，五氯硝基苯 0.002 μg/g，pp'-DDE 0.005 μg/g;4 號(hào)浙貝母六氯苯 0.002 μg/g，五氯硝基苯 0.011 μg/g;6號(hào)浙貝母檢出 β-BHC 0.011 μg/g，六氯苯 0.015 μg/g;1 號(hào)白芨檢出 δ-BHC 0.002 μg/g;4 號(hào)牛膝檢出四氯硝基苯 0.046 μg/g;3號(hào)天麻檢出西瑪津0.002 μg/g和5號(hào)天麻檢出西瑪津 0.01 μg/g，β-BHC 0.011 μg/g。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)所建立的農(nóng)藥檢測方法是根據(jù)中藥本身的特點(diǎn)建立起來的一套系統(tǒng)的針對(duì)不同類中藥材的有害殘留物檢測方法，在應(yīng)用中，各級(jí)監(jiān)測機(jī)構(gòu)可以根據(jù)需要選擇使用，能夠滿足科學(xué)研究、監(jiān)管監(jiān)測、外貿(mào)出口檢測等多種需求。多種有害殘留物限量標(biāo)準(zhǔn)的制定也將有利于提高我國中藥行業(yè)整體的監(jiān)管水平，提高我國中藥產(chǎn)品的質(zhì)量，解決一直沒有標(biāo)準(zhǔn)和方法的尷尬狀況，有力應(yīng)對(duì)國際貿(mào)易中對(duì)我國中藥產(chǎn)品設(shè)置的“綠色壁壘”。

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