GC-MS快速測定魚腥草注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法研究

陳 艷， 張永勇， 梁忠麗， 唐 嵐， 侯曉蓉

(1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州310014;2.中國計量學院生命科學院，浙江杭州310018)

中藥注射劑起效快、作用強，尤其在危重疾病急救及感染性疾病、心腦血管疾病、惡性腫瘤等疾病的治療上具有一定的優(yōu)勢，因而在臨床上廣為應(yīng)用［1］。但是，中藥注射劑臨床不良反應(yīng)事件近年呈增多趨勢［2］，其不良反應(yīng)主要為過敏反應(yīng)，約占不良反應(yīng)的80%，而類過敏反應(yīng)(pseudoanaphylaxis，anaphylactoid action)又占了過敏反應(yīng)中的76%［3］。類過敏反應(yīng)屬于非免疫反應(yīng)［4-5］，不需預(yù)先接觸抗原物質(zhì)，也無特異性抗體(IgE)參與，其過敏的關(guān)鍵機制是藥理性組胺釋放［6］，其釋放量與藥物劑量和注射速度相關(guān)。由于組胺是類過敏反應(yīng)的主要介質(zhì)，因此對它的監(jiān)測在中藥注射劑安全性評價中變得尤為重要。

目前對于組胺的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法［7-8］(enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA);熒光分光光度法和高效液相色譜法等。用ELISA法檢測組胺，靈敏度高，方法簡便，但價格昂貴，且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果;HPLC法一方面分析時間長，且樣品需要量大，衍生化步驟繁瑣［9］，另一方面，HPLC法中常用的衍生化試劑是鄰苯二甲醛(OPA)［10］，其存在熒光易淬滅，穩(wěn)定性差的缺點。相比之下，GC-MS技術(shù)檢測速度快，只需要15 min便可獲得結(jié)果，且樣品用量小，衍生化反應(yīng)一步完成。本實驗建立了GC-MS測定犬血漿中組胺的分析方法。

1 材料

1.1 藥品與試劑 吐溫 －80(Tween-80，德國Welding);甲基氨茴霉素(9-methylanthracene，sigma)氯甲酸乙酯(Ethylchloroformate，sigma)均由 Sigma-Aldrich上海微晶生物試劑有限公司提供;組胺磷酸鹽(純度＞99%，Bio basic Inc)由浙江大學生物試劑供應(yīng)中心提供。三乙胺、無水硫酸酮、無水乙醇，乙酸乙酯，丙酮，三氯甲烷等均為分析純。魚腥草干品(地上部分，華東醫(yī)藥試劑有限公司，產(chǎn)地浙江)。

1.2 樣品液的制備［11］魚腥草蒸餾液的制備，根據(jù)部頒標準魚腥草注射液生產(chǎn)工藝，取魚腥草干品5 kg進行水蒸氣蒸餾，收集初餾液5 L，再進行重蒸餾，收集重蒸餾液2.5 L(加入17.5 g氯化鈉)，即得2∶1魚腥草雙蒸餾液，灌封，滅菌，冷藏備用。

1.3 實驗動物 Beagle犬12只，體質(zhì)量8～13 kg，雄性，由浙江大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK(浙2003－0001)。實驗環(huán)境室溫25～30℃ ，相對濕度55% ～65% 。

1.4 主要儀器 氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(GC-MS)，5975-6890，Agilent;毛細管分析柱，DB-WAX 30 m ×0.25 mm 內(nèi)徑，0.25 μm 膜厚;微型渦旋儀(IKA 公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 將組胺磷酸鹽溶于超純水中即得10 mg/mL組胺標準貯備液。將9-methylanthracene溶于丙酮溶劑配成2 mg/mL內(nèi)標貯備液。均儲存于-20℃冰箱。

2.2 色譜條件 自動進樣器1 μL不分流進樣;程序升溫條件為起始溫度150℃下停留2 min，再以40℃/min的速度升至240℃，在該溫度下停留10 min;進樣口溫度為250℃;載氣為高純氦氣，恒體積流量為1 mL/min。離子源為 EI源，電子能量70 eV，全質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～200 amu。衍生化后樣品的色譜流出圖中(圖1，SIM模式)11 min和13.5 min處各有一色譜峰，tR=11 min是內(nèi)標的色譜保留時間，組胺標準物衍生化后的色譜保留時間為tR=13.5 min。

圖1 樣品氣質(zhì)聯(lián)用色譜流出圖(SIM，m/z 166，192)Fig.1 A selected mass chromatogram(SIM)of sample by GC-MS(selected ion:m/z 166，192)

2.3 質(zhì)譜條件 采用SIM選擇離子模式，選擇m/z 166為組胺的檢測離子(如圖2所示)，選擇m/z192為內(nèi)標9-methylanthracene的檢測離子(如圖3所示)。

圖2 內(nèi)標對應(yīng)的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrometry of 9-methylanthracene

圖3 組胺對應(yīng)的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectrometry of histamine

2.4 樣品前處理方法 衍生化方法按Klaus［12］方法略有改動，全血置于含肝素鈉的采血管中。低溫離心機3000 r/min，離心10 min，取上清100 μL加入1350 μL的反應(yīng)液(1110 μL的無水乙醇、240 μL 三乙胺、50 μL 2 μg/mL 的 9-methylanthracene、3.6 mL的丙酮)，于渦旋儀上渦旋3 s后加入550 μL衍 生 化 (100 μL Ethylchloroformate，900 μL CHCL3)，連續(xù)渦旋10 s;加入3.5 mL水再渦旋5 s，1500 r/min離心5 min，取有機相置一干凈瓶中，加入10 mg無水硫酸鈉脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用。各組重復(fù)測定3次。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍 取空白犬血漿1.0 mL5份，依次加入組胺標準溶液，配成質(zhì)量濃度分別為2、4、8、16、32 mg/L，按2.3項所描述的方法進行操作，進樣1 μL，記錄色譜圖，以組胺對照品為橫坐標，組胺與內(nèi)標物峰面積比值為縱坐標作線性回歸分析，回歸方程 Y=0.012X-0.015，r2=0.999，表明組胺在 2 ～32 mg/L范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。檢測限為0.7 mg/L(S/N=3)。

2.5.2 精密度實驗 取相同的供試品溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件及方法，重復(fù)進樣5次，依次測得對照品和內(nèi)標峰面積之比，計算RSD為1.97%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取上述供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h 進樣，依法測定，結(jié)果 RSD 為1.46%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率實驗 分別精密稱取已測定的同一批血漿樣品5份，各約100 μL，加入組胺對照品適量，精密加入內(nèi)標物溶液50 μL，按既定方法衍生化處理，記錄色譜，結(jié)果組胺衍生化物平均加樣回收率為100.7%，RSD為3.73%。結(jié)果見表1。

表1 組胺加樣回收率實驗結(jié)果Tab.1 Recovery test results of histamine

2.6 樣品測定 12只犬隨機分為4組，分別為生理鹽水組(A組)、含0.5%吐溫-80魚腥草注射液組(B組)、含1%吐溫－80的魚腥草注射液組(C組)、不含吐溫-80的魚腥草注射液組(D組)。各組均用生理鹽水稀釋，給藥體積為5.0 mL/kg，選犬前肢靜脈滴注，連續(xù)觀察30 min后隨即抽取各組犬靜脈血用于血漿組胺測定。測定結(jié)果見表2。

表2 犬血漿組胺測定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Test results of sample (n=3)

3 討論

本實驗中，樣品衍生化無疑是GC-MS檢測過程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，目的是將發(fā)射基團引入無紫外吸收的組胺，形成穩(wěn)定的紫外吸收衍生化物，把難于分析的組胺轉(zhuǎn)化為與其化學結(jié)構(gòu)相似但易于分析的組胺衍生物，便于量化和分離。本研究中利用組胺衍生化劑ECF與組胺中的N離子結(jié)合發(fā)展了一種簡單、快速，溶劑消耗大大減少的組胺樣品前處理衍生化方法，同時結(jié)合GC-MS分析儀高靈敏度和高準確性等優(yōu)點建立一種簡單、準確、快捷的生物樣品中組胺GC-MS定量分析方法。使用SIM選擇離子方式檢測組胺的特征離子碎片，色譜圖中只有目標峰和內(nèi)標峰，無其他雜質(zhì)峰的干擾，對于定量分析能夠較精確。我們的檢測結(jié)果表明，GC-MS檢測組胺靈敏度高，最低檢測線達7 ng/mL，標準曲線有良好的相關(guān)性(r2=0.999)，相對回收率大于90% ，完全能滿足臨床和科研中組胺血藥濃度檢測的需要。GC-MS在目前眾多的檢測技術(shù)中是組胺定性、定量的最佳手段。

吐溫-80作為增溶、乳化劑，是中國藥典收載的藥用輔料而廣泛用于中藥注射劑，但近年出現(xiàn)的中藥注射劑臨床致敏事件使得吐溫-80在注射劑中的用法及用量成為關(guān)注的焦點。本實驗運用GC-MS對含不同質(zhì)量分數(shù)吐溫-80的魚腥草注射液致敏后組胺含量測定結(jié)果表明，含吐溫-80量超過0.5%的魚腥草注射劑致比格犬體內(nèi)釋放過敏介質(zhì)組胺的量與不含吐溫-80的魚腥草注射劑致組胺釋放量比較有統(tǒng)計學差異，當含吐溫-80量達到1%以上時，機體釋放組胺的量與陰性組比較有顯著性差異。研究結(jié)果提示我們，為了避免出現(xiàn)臨床類過敏反應(yīng)，吐溫-80在中藥注射劑中的加入質(zhì)量分數(shù)最好控制在0.5%以下。本研究分析過程簡單、快速，溶劑消耗量少，分析成本低，是一種適合中藥注射劑生產(chǎn)質(zhì)量控制的分析方法，對減少中藥注射劑引起類過敏反應(yīng)具有重要的意義。本實驗為中藥注射劑安全性評價提供了一種有效的方法。

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