甲基化在食管胃結合部腺癌及胃遠端腺癌的表達

西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科（西安710061）

劉 棣△ 刁冬梅 程 遙 汪建光 張 昊 袁達偉 黨誠學▲

食管胃交界腺癌（Adenocarcino ma of esophagogastric junction，AEG）是指發(fā)生于食管胃交界EGJ（Gastroesophageal j unction，GEJ）區(qū)域的腺癌。多數學者認為AEG是一類獨特的臨床病理類型。近年來，食管胃交界部腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢。近年，各國學者開始對其病因、分類、治療進行了深入研究［1］。目前，有關AEG分類主要有，WHO和Siewert兩種。2000年時，WHO對食管胃交界腺癌定義為穿過食管胃交界處的腺癌，不管腫瘤的主體在何處。Siewert在1987年將EGJ近側和遠側5c m之內的腺癌稱作食管胃交界腺癌，并提出了相應的局部解剖學分型。目前研究顯示：食管胃結合部腫瘤中發(fā)生機制和生物學行為方面可能不同于非EGJ區(qū)域的胃癌，為一種類型獨特的腫瘤。因此，為揭示胃癌發(fā)生的分子機制，探討不同部位胃癌的分子生物學特性顯得尤為重要。

材料方法

1 標本與試劑 26例食管胃結合部腺癌和28例胃遠端部腺癌手術切除標本取自西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科標本庫。所有患者術前均未接受任何放療、化療。食管胃結合部腺癌納入標準為：腫瘤位置介于齒狀線遠心側且位于齒狀線下5c m以內，齒狀線清晰可見，未累積，病理證實為腺癌。手術標本部分送病理科常規(guī)組織學檢測，取小部分新鮮標本置液氮保存。標本在冰面，取癌組織、正常組織（距癌＞5c m）、癌旁組織（距離癌3～5c m）。組織獲取均征得患者及家屬知情同意。DNA提取試劑盒購于天根公司，DNA甲基化修飾試劑盒購于Millipore公司，Taq酶，d NTP購自TAKARA公司，其它試劑購自西安沃爾森公司。

2 檢測方法

2．1 DNA的提取 取腫瘤、正常、癌旁組織約30 mg，研磨，按天根TIANa mp Geno mic DNA Kit試劑盒操作步驟提取DNA，得DNA約10～30μg。

2．2 亞硫酸鹽修飾 按照Cp Geno me Tur bo Bisulfite Modification Kit操作步驟。取1．5 ml離心管，加入 1．0μl 3 N Na OH ，1．0μg 已抽提的 DNA（10μl）。37°C 水浴10 min。加120μl新鮮配制的亞硫酸氫鈉（DNA修飾試劑），漩渦混勻。70°C 水浴40 min。加500μl DNA結合緩沖液，將修飾DNA純化柱放入2 ml收集管，將樣本移入離心柱，離心11 000×g 1 min，棄去收集管中液體。加入700μl DNA洗脫緩沖液 離心11 000×g 1 min。加200μl新鮮配制的去硫溶液到離心柱的中心。室溫放置15 min，離心11 000×g 1 min，棄去收集管中液體．加入700μl DNA洗脫緩沖液 離心11 000×g 1 min。重復次步1次。將離心柱放入一新的1．5 ml離心管，離心11 000×g 1 min。將離心柱放入一干凈1．5 ml離心管，加入25μl DNA溶解緩沖液，室溫放置1 min，全速離心1 min。樣本保存于－20°C。

2．3 甲基化特異性PCR 依照甲基化特異性PCR（Met hylation specific PCR，MSP）方法［2］，對每一個標本進行亞硫酸鹽修飾，然后分別用甲基化和非甲基化引物進行PCR反應。采用25μl反應體系：10×緩沖液 2．7μl，d NTP（2．5μmol/L）3μl，正向引物（10μmol/L）2μl，反向引物（10μmol/L）2μl，模板 DNA 4μl，Taq DNA聚合酶0．3μl，去離子水補總反應體系至25μl。反應條件：95°C 預變性5 min，循環(huán)：95°C 30s，退火溫度因不同基因而不同30s，72°C 30s，共40個循環(huán)，最后72°C延伸10 min，4°C保存產物。

引物由北京華大基因公司合成：①RASSF1 A［2］：MF gtgttaacgcgttgcgtatc MR aaccccgcgaactaaaaacga；UF tttggtt ggagtgt gttaatgt g UR caaaccccacaaactaaaaacaa；②RASSF2［3］：MF ttttttttttttgagttcgc MR ctaaaaaacgacgacgaact；UF tttttttttttttttgagttt gt UR cctaaaaaacaacaacaaacta； ③ RUNX3［4］： MF ttacgaggggcggtcgtacgcggg MR aaaacgaccgacgcgaacgcctcc；UF ttat gaggggt ggttgtatgt ggg UR aaaacaaccaacacaaacacctcc。

2．4 結果鑒定 配制3%瓊脂糖凝膠，PCR產物用溴酚藍染色，取5～10μl產物，加樣于瓊脂糖凝膠加樣孔，置于電泳槽中電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓180 V。當溴酚藍條帶遷移至瓊脂糖凝膠2/3處時終止電泳，紫光燈下觀察電泳條帶，凝膠成像儀采集圖像。若甲基化引物擴增出現條帶，而非甲基化無條帶擴增，為純合型甲基化。說明該病例發(fā)生甲基化，若非甲基化引物擴增出現條帶，說明該病例處于非甲基化狀態(tài)。若兩對引物均擴增出目的條帶，則為雜合型甲基化。采用Raji細胞株［5］作為陽性對照，Hela細胞株［6］作為陰性對照。

3 統(tǒng)計學處理 本組所有資料均采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計處理，組間樣本率比較采用四格表資料χ2檢驗（Chi－square Test）和行X列表資料的χ2檢驗，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

1 AEG、GDA及癌旁正常組織中各基因甲基化率對比 見表1及附圖。食管胃結合部腺癌組織、癌旁不典型增生組織、癌旁正常組織中RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為65．38%，26．92%，15．38%，而在胃遠端腺癌中的甲基化發(fā)生率分別為53．57%，17．86%，14．29%。RASSF2在食管胃結合部和胃遠端腺癌中的甲基化為69．23%、57．14%，在不典型增生中的甲基化為30．77%和21．43%，在正常組織中為19．23%和17．86%。RUNX3在食管胃結合部和胃遠端腺癌中的甲基化分別為（61．54%VS 53．57%），在不典型增生中（23．08%VS 25%），在癌旁正常組織（11．54%VS 10．71%）。甲基化在 RASSF1A、RASSF2和RUNX3在食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌之間的表達情況無顯著性差異（P＞0．05），但每一個基因的甲基化發(fā)生率，隨著相應部位黏膜病理病變的加重而呈上升趨勢（P＜0．05）。

表1 食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌在腫瘤、癌旁不典型增生、癌旁正常組織中的甲基化情況比較

附圖 腫瘤（T）、不典型增生（AH）及癌旁正常（N）組織甲基化電泳圖 M示甲基化引物擴增反應；U示非甲基化引物擴增反應

2 癌和正常組織中 RASSF1A、RASSF2和RUNX3甲基化發(fā)生率比較 見表2。癌組織中RASSF1A、RASSF2和RUNX3甲基化發(fā)生率明顯高于癌旁正常組織（P＜0．05）。

表2 腫瘤與相應癌旁正常組織甲基化發(fā)生率比較

討 論

近年來表觀遺傳學是國內外研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的熱點。遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因雜合性缺失及微衛(wèi)星體不穩(wěn)定。而表觀遺傳學則不同，他研究的是基因修飾后序列未發(fā)生改變情況下，基因表達水平改變。常見的就是甲基化、組蛋白乙?；叭旧|構象變化。DNA甲基化發(fā)生在啟動子區(qū)Cp G島，其中的胞嘧啶在DNA甲基轉移酶的作用下轉變?yōu)?－甲基胞嘧啶（mC）。甲基化在哺乳動物正常的生長、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。而一些異常的甲基化則會形成細胞內的無序狀態(tài)而促進腫瘤的發(fā)生。正常情況下，基因啟動子區(qū)Cp G島處于非甲基化狀態(tài)，當其發(fā)生甲基化時，會導致基因轉錄抑制，使其功能喪失，從而導致正常細胞生長、分化調控失常，DNA損傷不能及時修復，這將可能引起腫瘤的發(fā)生。目前對于賁門癌的發(fā)病機制研究尚不清楚，有報道約半數的賁門癌與Barrett食管有關。

RASSF1A基因位于人染色體3p21．3區(qū)位點的抑癌基因，參與細胞的增殖和凋亡、維持微管穩(wěn)定性。RASSF1A在多種惡性腫瘤，如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、結腸癌中表達下調或缺失，啟動子Cp G島異常甲基化和雜合性缺失是主要原因［7，8］。RASSF2是RASSF1家族中的一個成員，近年研究表明，它在胃癌中頻繁甲基化，可能也是一個抑癌基因［9］。已經有相關研究證實RASSF1A和RASSF2在口腔鱗狀細胞癌中的甲基化與預后有密切的關系［10］。RUNX3基因位于染色體1p36．1，對脊神經節(jié)的神經發(fā)育及胃黏膜上皮的增生有調節(jié)作用。作為一個抑癌基因，調控細胞生長發(fā)育和細胞凋亡，它的缺失或失活可以導致胃黏膜上皮細胞增生和分化異常。

食管胃結合部腫瘤是一類較特殊的腫瘤，預后不良。目前對于賁門癌的發(fā)病機制研究尚不清楚，有報道約半數的賁門癌與Barrett食管有關。本研究中，在食管胃結合部和胃遠端腫瘤中，甲基化的發(fā)生率都要明顯高于其相應的正常組織，然而食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌的甲基化程度無顯著性差異。由此可見，相關基因高甲基化狀態(tài)可能是引起食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌的共同分子機制之一。

食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌的甲基化發(fā)生率要明顯高于其相應的癌旁不典型增生組織，也高于癌旁正常組織。我們可以推測：食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌的發(fā)生與甲基化的發(fā)生有密切的關系。過往的研究認為，食管胃結合部腺癌和胃遠端腺癌，在病理發(fā)生上存在不同，我們對比了這兩種腫瘤的甲基化發(fā)生率，發(fā)現無顯著性差異，這可能與本組病例數較少有關。為探明它們發(fā)生的分子生物學區(qū)別，需要進一步研究。但目前已開展的表觀遺傳學的腫瘤治療，可能同樣應用于這兩種腫瘤。

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