RECK蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與MMP－9的關(guān)系＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（西安710004）

張 潔 李雅莉 楊 俠 張進(jìn)召 張秋紅 明宗娟 張永紅 周淑茹

RECK是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因，廣泛表達(dá)于人體的多個(gè)組織中，在腫瘤組織中幾乎不表達(dá)或微量表達(dá)，在癌旁正常組織中表達(dá)是正常的［1］。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道RECK基因有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）降解ECM的作用，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移并改善預(yù)后。本研究采用免疫組化法在蛋白水平檢測(cè)RECK及基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）癌組織及非癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系，為RECK在NSCLC的基因治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 NSCLC（鱗癌和腺癌）病例50例，術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療。其中男34例，女16例；年齡34～76歲，中位年齡61歲；肺鱗癌27例，肺腺癌23例；高分化6例，中等分化24例，低分化20例；TNM分期：I期9例，II期16例，III期15例，IV期10例；肺門和（或）縱隔淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)移）：有轉(zhuǎn)移31例，無轉(zhuǎn)移19例。另選取20例非癌組織，其中男14例，女6例，年齡42～69歲，中位年齡63．5歲；11例為癌旁正常肺組織，6例為慢性炎癥，3例為正常肺組織。

2 方 法 采用免疫組化SP法。鼠抗人RECK mAb多克隆抗體（第一抗體）和兔抗人MMP－9 mAb多克隆抗體（第一抗體）購(gòu)自美國(guó)Santa Cr uz公司；UltraSensitive T MS－P超敏試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。全部標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚4μm，然后進(jìn)行免疫組化染色，免疫組化染色過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。兩種一抗實(shí)際工作濃度1∶100，使用PBS緩沖液（0．01 mol/L，p H＝7．4）代替RECK抗體及 MMP－9抗體作陰性對(duì)照，使用已知陽性的食管癌切片做陽性對(duì)照。

3 結(jié)果判定 根據(jù)視野中陽性細(xì)胞所占比例作為該切片陽性細(xì)胞的百分率進(jìn)行評(píng)分：＜30%為1分，30%～70%為2分，＞70%為3分。以多數(shù)呈現(xiàn)的染色特征為計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。最后以陽性細(xì)胞百分率計(jì)分和染色強(qiáng)度計(jì)分相加所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定：0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽性（＋），≥4分為強(qiáng)陽性（），弱陽性和強(qiáng)陽性統(tǒng)計(jì)為陽性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法及分類變量的關(guān)聯(lián)性分析（r）等方法，分析免疫組化結(jié)果與患者臨床特征、病理類型等的關(guān)系，α取0．05。

結(jié) 果

1 RECK和MMP－9在肺癌組織和非癌組織中的表達(dá) 見表1。RECK蛋白陽性表達(dá)主要在細(xì)胞漿，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒呈均勻分布。RECK蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)率為20．0%（10/50），而在非癌組織中的陽性表達(dá)率為90．0%（18/20），兩者有顯著性差異（P＜0．001）。MMP－9蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒呈均勻分布。MMP－9蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)率為88．1%（44/50），而在非癌組織中的陽性表達(dá)率為15．0%（3/20），兩者有顯著性差異（P＜0．001）。提示RECK蛋白在癌組織中呈低表達(dá)，在非癌組織中呈高表達(dá)；而MMP－9蛋白在癌組織中呈高表達(dá)，在非癌組織中呈低表達(dá)。

表1 RECK和MMP－9蛋白在NSCLC癌組織和非癌組織中的表達(dá)

2 RECK和 MMP－9的表達(dá)及其NSCLC臨床特征的關(guān)系 見表2。在肺癌組織中，RECK及MMP－9的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、是否吸煙及吸煙量、病理類型、分化程度無明顯關(guān)系（P 均＞0．05），與患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P均＜0．05）。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且TNM分期早期的患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）TNM 晚期患者的RECK蛋白表達(dá)水平升高，而MMP－9則降低，兩者之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．001）。

表2 RECK和MMP－9與肺癌臨床特征之間的關(guān)系

3 RECK和MMP－9蛋白表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中的關(guān)系 在50例標(biāo)本中，有40例NSCLC患者癌組織RECK蛋白表達(dá)陰性而MMP－9蛋白表達(dá)陽性；有6例NSCLC患者癌組織RECK蛋白表達(dá)陽性而MMP－9蛋白表達(dá)陰性。兩者經(jīng)χ2檢驗(yàn)及相關(guān)性分析，有負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2＝27．273，r＝－0．739，P＜0．001）。

討 論

RECK基因廣泛表達(dá)于人體的多個(gè)組織中，但在腫瘤組織中幾乎是不表達(dá)或微量表達(dá)的。RECK的mRNA能在非轉(zhuǎn)染的NI H/3 T3細(xì)胞中表達(dá)，但是在ras轉(zhuǎn)染的NI H3T3細(xì)胞中卻不表達(dá)或表達(dá)下降，原癌基因如ras、myc、mos、src等可下調(diào)RECK基因的表達(dá)［1］，通過抑制RECK基因來實(shí)現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs可釋放抑制細(xì)胞凋亡的生物活性分子，并通過分解ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）來刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［2］。MMPs還可通過促進(jìn)血管生成，封閉免疫監(jiān)視，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［3］。MMPs在人體正常組織中的表達(dá)和活性是非常低的，并且是被精細(xì)調(diào)節(jié)的［4］。但當(dāng)機(jī)體處于組織重塑時(shí)期或是在病理情況下如癌癥時(shí)，可迅速誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)和活性［5］。

RECK基因?qū)MPs的抑制是一個(gè)復(fù)雜的多階段的過程，包括轉(zhuǎn)錄水平的抑制，mRNA水平的抑制，蛋白酶的分泌和蛋白酶活性的抑制過程，通過這些復(fù)雜的過程，抑制ECM的降解和腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Taku等［6］發(fā)現(xiàn)在RECK基因敲除的小鼠胚胎期，雖然有新生血管形成，但血管的成熟受到明顯抑制，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)這些變異的胚胎體積小，間充質(zhì)混亂，缺乏膠原纖維，有異常的組織發(fā)生；而恢復(fù)RECK基因的表達(dá)可抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生。RECK可抑制MMPs，從而抑制腫瘤的進(jìn)展，并且是一個(gè)獨(dú)立的顯著的預(yù)后因素，RECK基因表達(dá)水平高的患者預(yù)后明顯好于表達(dá)水平低的患者。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RECK和MMP－9在非癌組織和癌組織中均有表達(dá)，RECK在癌組織中的表達(dá)水平較非癌組織顯著降低，而MMP－9的表達(dá)情況則反，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001），可推測(cè)肺癌組織中RECK基因被抑制，而MMP－9基因被誘導(dǎo)表達(dá)增加。RECK及MMP－9蛋白表達(dá)和NSCLC患者的性別、年齡及吸煙指數(shù)無關(guān)，這與Norihiro等［7］及Kazu masa等［8］研究結(jié)果相符。這說明雖然肺癌的發(fā)生及病理組織類型有性別、年齡的差異，但它們與肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移沒有直接的關(guān)系；煙草雖然是肺癌最重要的危險(xiǎn)因素，但它與RECK和MMP－9蛋白表達(dá)水平及調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系甚微。RECK蛋白與 MMP－9蛋白表達(dá)與NSCLC的病理類型、分化程度無關(guān)，而與TNM分期有密切關(guān)系，TNM分期越晚，RECK蛋白表達(dá)越低，MMP－9蛋白表達(dá)越高，提示 MMP－9可促進(jìn)NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移，而RECK基因可抑制NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。故MMP－9可作為判斷肺癌早期轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)，而RECK基因可作為判斷肺癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中，RECK蛋白表達(dá)陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；而 MMP－9蛋白表達(dá)陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示淋巴結(jié)作為局部免疫器官，在NSCLC的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

RECK基因與MMP－9之間存在著顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)果提示，RECK基因可能是 MMP－9的負(fù)調(diào)節(jié)因子，RECK基因通過抑制MMP－9發(fā)揮抑癌作用。當(dāng)NSCLC患者癌組織中的RECK基因被致癌信號(hào)下調(diào)之后，解除了對(duì)MMP－9分泌和活性的抑制，促進(jìn)了NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。基于RECK基因與MMP－9之間的這種負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以作為肺癌RECK基因治療的理論基礎(chǔ)，通過上調(diào)RECK基因，抑制MMP－9基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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