櫻桃葉多糖的抗氧化活性研究

劉德勝，劉為忠，顏 玲

(1.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003;2.中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島 266003)

櫻桃葉，收錄于《中華本草》，為薔薇科植物櫻桃(Prunus pseudocerasus Lindl.)的葉片，味辛苦、性溫、無(wú)毒，具有溫胃、健脾、止血、解毒的功效，還能降壓、治胃寒食積、腹瀉、吐血、瘡毒等［1］。櫻桃葉中含有黃酮［2］、揮發(fā)油［3］等。目前對(duì)櫻桃葉多糖(PPP)的藥理作用方面的研究尚未見報(bào)道。在前期研究中，我們對(duì)櫻桃葉中的多糖進(jìn)行了定性鑒別和含量測(cè)定。本文對(duì)櫻桃葉提取水溶性多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料

櫻桃葉采自山東煙臺(tái)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院劉孟安教授鑒定為薔薇科植物、品種為大紅燈櫻桃的葉片。

丙二醛(MDA)測(cè)試盒和總蛋白定量測(cè)試盒(BCA法)，南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(純度＞96%)，阿拉丁試劑公司。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司;RE-52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Biofuge Primo。

SD大鼠，雄性，220 g左右，山東綠葉制藥有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(魯)20030020。

2 方法與結(jié)果

2.1 PPP的制備與含量測(cè)定

櫻桃葉烘干粉碎后，用石油醚和乙醇脫色、脫雜后，風(fēng)干，粉末用水(1∶40)加熱浸提，靜置離心，濃縮至原體積30%，濃縮液加入4倍體積的95%乙醇沉淀，沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮及乙醚洗滌，用水復(fù)溶，透析，Sevag法除蛋白，真空干燥灰白色PPP;用硫酸-蒽酮法測(cè)定多糖含量為53.7%。

2.2 總還原能力的測(cè)定

將 PPP 配成多糖濃度為 40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg/mL 的溶液，同時(shí)采用相同濃度的Vc作為對(duì)照。采用文獻(xiàn)方法［4］，準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品液1.0 mL，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL，1.0%K3［Fe(CN)6］溶液 2.5 mL，50℃水浴30 min，急速冷卻后加入10.0%三氯醋酸2.5 mL，混合后加入 0.3%FeCl3溶液 0.5 mL，混勻后，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值，每個(gè)濃度平行做3管，取平均值。觀察在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，PPP濃度和A值之間的關(guān)系。一般情況下，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高。根據(jù)本方法，各個(gè)樣品反應(yīng)后的生成物在700 nm處的A值大小即反映了其抗氧化能力的大小。隨著PPP濃度的增加，A值也隨之增大，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，PPP總還原能力隨著濃度的增大而增大;與Vc相比，PPP的總還原能力稍弱。結(jié)果見圖1。

圖1 櫻桃葉多糖總還原能力測(cè)定圖(λ=700 nm)Fig.1 Total reducing power of PPP(λ =700 nm)

采用鄰苯三酚自氧化法［6］測(cè)定PPP對(duì)的清除能力。加0.05 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.2)4.5 mL于試管中，置25℃水浴20 min。加入不同濃度(40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg/mL)的 PPP 溶液或者Vc溶液0.4 mL和25℃的鄰苯三酚溶液(10 mmol/L HCl溶液配制)80 μL，加入后快速搖勻，測(cè)定在325 nm波長(zhǎng)處的A值，每隔0.5 min記錄1次，連續(xù)記錄4 min，計(jì)算各管的氧化速率及對(duì)的清除率。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著PPP濃度的增大，其清除的能力也隨之增高，PPP濃度為200.0 μg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到 23.5%;PPP 對(duì)的IC50為991.4 μg/mL，同等條件下 Vc 的 IC50為281.9 μg/mL;說(shuō)明 PPP 對(duì)的清除能力較強(qiáng)，但弱于同等濃度下的Vc清除能力。結(jié)果見圖3。

2.3 對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

采用Fenton法［5］測(cè)定 PPP對(duì)·OH的清除作用。在10 mL試管中加入9.0 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9.0 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL、不同濃度(40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg/mL)的 PPP 溶液1 mL，最后加入8.8 mol/L H2O21 mL啟動(dòng)反應(yīng);以水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定各濃度樣品的A值。每個(gè)濃度的樣品重復(fù)測(cè)定3次取平均值。隨著PPP濃度的增大，其清除·OH的能力隨之增強(qiáng)，PPP濃度為200.0 μg/mL時(shí)，清除率能達(dá)到77.6%;PPP 對(duì)·OH 的 IC50值為 100.5 μg/mL，相同條件下 Vc對(duì)·OH的IC50值為41.9 μg/mL。說(shuō)明PPP對(duì)·OH的清除能力較強(qiáng)，但弱于同等濃度下的Vc。結(jié)果見圖2。

圖2 櫻桃葉多糖清除·OH能力圖Fig.2 Scavenging effects of PPP on ·OH free radicals at different concentrations

2.4 對(duì)超氧負(fù)離子()的清除能力

圖3 櫻桃葉多糖對(duì)的清除能力Fig.3 Scavenging effects of PPP onfree radicals at different concentrations

2.5 對(duì)有機(jī)自由基(DPPH·)的清除能力

用無(wú)水乙醇作為溶劑，將DPPH配制成濃度為40 μg/mL 的溶液，PPP 配制成濃度為 50.0，100.0，200.0，250.0 和 300.0 μg/mL 的系列溶液，用相同濃度的Vc作為對(duì)照。每次取待測(cè)溶液2 mL與預(yù)先配制好的40 μg/mL DPPH溶液2 mL在25℃下反應(yīng)30 min后，測(cè)定其525 nm波長(zhǎng)處的A值［7］。

實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著PPP濃度的增大，其清除DPPH·的能力也隨之增高，濃度為300.0 μg/mL時(shí)，清除率能達(dá)到74.4%;PPP對(duì)DPPH·的IC50值為 135.1 μg/mL，同等條件下 Vc 的 IC50為 20.9 μg/mL;低濃度下清除能力遠(yuǎn)小于同等濃度下的Vc清除能力，在高濃度下和Vc清除能力相差不大。結(jié)果見圖4。

圖4 櫻桃葉多糖對(duì)有機(jī)自由基的清除能力圖Fig.4 Scavenging effects of PPP on DPPHo free radicals at different concentrations

2.6 PPP對(duì)大鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響［8］

在0～4℃下，SD大鼠脫頸椎處死，于肝門靜脈注射生理鹽水至肝臟變?yōu)橥咙S色，迅速取肝臟，勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用，使用蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用生理鹽水制成100 g/L的組織勻漿。PPP及 Vc濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5 和 3.0 mg/mL。每個(gè)濃度平行 3 管，每管加組織勻漿0.5 mL，不同濃度 PPP溶液0.1 mL，混勻。37℃溫育2 h，按照試劑盒要求及說(shuō)明操作，測(cè)定MDA含量，并計(jì)算抑制率。

結(jié)果(圖5)表明，隨著PPP濃度增大，其抑制大鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化所產(chǎn)生的MDA能力也隨之增強(qiáng)，PPP濃度為3.0 mg/mL時(shí)，抑制率能達(dá)到90.4%;PPP 該作用的 IC50值為 1.5 mg/mL，相同條件下Vc的IC50為0.9 mg/mL;與相同濃度的Vc相比，其抑制能力稍弱。

2.7 PPP對(duì) H2O2誘導(dǎo)大鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的影響［8］

同2.6項(xiàng)下制備100 g/L的大鼠肝臟組織勻漿。先在各管中加入100 g/L肝勻漿0.5 mL，各濃度(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL)PPP 或 Vc 溶液0.1 mL，37℃溫育振蕩反應(yīng)15 min，再向各管中加入 100 mmol/L H2O20.1 mL，繼續(xù)溫育反應(yīng)30 min，各管中加入200 g/L三氯乙酸1.5 mL終止反應(yīng)，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入617 g/L 2-硫代巴比妥酸溶液1.5 mL，并置沸水中15 min。同2.6項(xiàng)下測(cè)定MDA含量，并計(jì)算抑制率。

圖5 櫻桃葉多糖對(duì)大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響Fig.5 Effect of PPP on MDA generation spontaneously in liver of rats

結(jié)果(圖6)表明，隨著PPP濃度的增大，其抑制大鼠由H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化能力也隨之增強(qiáng)，PPP濃度為3.0 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到86.5%，PPP該作用的IC50值為0.9 mg/mL，相同條件下Vc的IC50值為0.5 mg/mL;和同等濃度的Vc相比，其抑制大鼠肝臟由H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDA效果稍弱。

圖6 櫻桃葉多糖對(duì)大鼠肝勻漿誘導(dǎo)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響Fig.6 Effect of PPP on MDA generation induced by H2O2in liver of rats

3 討論

植物來(lái)源的多糖類化合物擁有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性以及降血糖、降血脂活性和抗氧化等的獨(dú)特功能，而且大多數(shù)毒性較小，在預(yù)防疾病上優(yōu)于其他化合物，因此其應(yīng)用具有廣闊的前景［9］。本研究了PPP的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，PPP對(duì)自由基的清除能力依次為·OH＞DPPH·，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)的清除率，對(duì)大鼠肝臟自發(fā)性和由H2O2誘導(dǎo)的產(chǎn)生的MAD也均有較強(qiáng)抑制能力;但弱于同等濃度下的Vc抗氧化能力，說(shuō)明PPP對(duì)不同類型自由基的清除能力不同。櫻桃是煙臺(tái)地區(qū)特產(chǎn)，櫻桃葉來(lái)源廉價(jià)而廣泛，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用櫻桃葉這一傳統(tǒng)中藥提供依據(jù)。

［1］國(guó)家中醫(yī)藥管理局，《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.第四冊(cè)(第十卷).上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998:2586.

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