鱘魚硫酸軟骨素的免疫調(diào)節(jié)及抗炎抗過敏活性

黃世玉，李江森，關(guān)瑞章，黃文樹

(1.集美大學 水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021;2.福建省高校水產(chǎn)科學與食品安全重點實驗室，福建 廈門361021)

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate，ChS)是存在于動物軟骨組織中的一類具有多種異構(gòu)體的酸性黏多糖，具有抗炎［1］、抗血栓［2］、抑制腫瘤細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等作用［3-5］。

ChS的主要來源是家禽、家畜和鯊魚等動物軟骨，但家禽、家畜的軟骨含量低，鯊魚是國家野生保護動物，資源相對缺乏。目前，中國的鱘魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展良好，且鱘魚的軟骨含量相當高(提取率為31.56%［6］)，鱘魚 ChS 的提取工藝較為成熟［6］。前期的研究表明，鱘魚ChS的化學結(jié)構(gòu)不同于家禽、家畜以及鯊魚等的ChS［7-8］。有關(guān)鱘魚中ChS生物活性未見報道，本文研究其免疫調(diào)節(jié)及抗炎抗過敏等作用，為鱘魚ChS的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

鱘魚(史氏鱘，Acipenser schrenki Brandt)，屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，購自福建省廈門市同安某鱘魚養(yǎng)殖場。

雞紅細胞(chicken red blood cells，CRBC)由市售雞無菌取血，以阿氏液抗凝離心沉淀后配成10%和5%的CRBC混懸液，保存于4℃冰箱，在2周內(nèi)使用。

鯊魚ChS對照品購自Sigma公司。

清潔級KM小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所繁育中心，合格證號:SCXK(京)2005-0013。并于集美大學水產(chǎn)學院SPF實驗動物中心飼養(yǎng)，SYXK(閩)2007-001。

2 方法

2.1 鱘魚ChS的提取

參考徐傳屯等［6］的方法提取鱘魚ChS粗品，綜合利用乙醇和色譜法對粗品進行純化，純度通過咔唑法測定。根據(jù)產(chǎn)品中葡萄糖醛酸含量換算得到的鱘魚ChS純度為96.18%。

2.2 分組及給藥方法

小鼠隨機分成鱘魚ChS高、中、低劑量組、鯊魚ChS組和對照組等5組，每組10只。給藥劑量參考ChS成人用藥量［9-10］，高、中、低劑量組分別為 600，60和6 mg/kg;鯊魚ChS組采用鯊魚ChS對照品60 mg/kg;對照組給生理鹽水;灌胃給藥，0.5 mL/次，1次/d。

2.3 鱘魚ChS對免疫器官重量指數(shù)的測量

連續(xù)灌胃14 d，在最后一次灌胃的24 h后，稱重，脫頸椎處死小鼠，剖取胸腺和脾臟并稱重。

2.4 鱘魚ChS對外周血白細胞分析

連續(xù)灌胃14 d，在最后一次灌胃的24 h后，眼球采血0.1 mL，以EDTA抗凝送往廈門第二醫(yī)院血液檢查科檢驗。

2.5 鱘魚ChS對遲發(fā)型變態(tài)反應

在連續(xù)灌胃7 d后，每鼠腹腔注射10%CRBC混懸液200 μL致敏，于第14天灌胃后24 h，每只小鼠右后足墊注射10%CRBC混懸液 20 μL，用游標卡尺測量注射前、注射后1及24 h右足墊的厚度，計算其腫脹度。

2.6 鱘魚ChS對體液免疫功能-血清溶血素含量的測定(CRBC免疫法)

在連續(xù)灌胃7 d后，每鼠腹腔注射10%CRCB混懸液200 μL進行免疫。飼養(yǎng)7 d后從小鼠眼眶取血并分離出血清測定溶血素含量。每只小鼠取血清10 μL，用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1 mL 與5%CRBC 混懸液 0.5 mL、10%補體 0.5 mL混合，在37℃下保溫30 min，冰水浴上終止反應。離心取上清液，測定在540 nm波長處的吸光度值，以不加血清的空白作對照。以吸光度值作為判斷血清溶血素的指標。

2.7 鱘魚ChS對二甲苯誘發(fā)小鼠耳過敏性腫脹的測定

連續(xù)灌胃14 d，末次灌胃后24 h在小鼠的右耳正反兩面涂抹二甲苯20 μL致炎，左耳不做處理，4 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用9 mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓耳片，稱重。用左、右耳片重量差值作為腫脹度。

2.8 鱘魚ChS對蛋清致足墊炎的測定

連續(xù)灌胃14 d，末次灌胃后24 h每鼠右后足墊注射10%蛋清溶液20 μL，用游標卡尺測量注射前及注射后30 min及4 h右足墊的厚度，計算腫脹度。

3 結(jié)果

3.1 鱘魚ChS對免疫器官重量指數(shù)的影響

結(jié)果見表1。鱘魚ChS三個劑量組和鯊魚ChS組的小鼠脾指數(shù)均顯著高于對照組(P＜0.01)，但鱘魚ChS三個劑量組間及其與鯊魚ChS組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。對于胸腺指數(shù)，只有鱘魚ChS 600 mg/kg劑量組顯著高于對照組(P＜0.05)，其他各組間沒有顯著差異(P＞0.05)。

3.2 鱘魚ChS對外周血白細胞數(shù)量的影響

結(jié)果見表1。鱘魚ChS三個劑量組和鯊魚ChS組的外周血中的白細胞數(shù)量均顯著高于對照組(P＜0.05)，白細胞中的淋巴細胞數(shù)量顯著增加(P＜0.01)，此外，與鯊魚 ChS組相比，鱘魚 ChS 60和600 mg/kg劑量組的白細胞數(shù)量均顯著增高(P＜0.01)，主要也是由于淋巴細胞數(shù)量顯著增加(P＜0.01)。且在60和600 mg/kg劑量時除淋巴細胞數(shù)增加外，中性細胞數(shù)也顯著性增加(P＜0.05)。

3.3 鱘魚ChS對遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

結(jié)果見表2和圖1。與對照組和鯊魚ChS組相比，鱘魚ChS 60和600 mg/kg劑量組，在注射CRBC后1 h小鼠右后足墊的腫脹度顯著提高(P＜0.01)，鯊魚 ChS組顯著提高(P ＜0.05);在注射24 h后對照組和實驗組對比注射前均出現(xiàn)顯著性腫脹(P ＜0.05)，且腫脹度明顯高于對照組(P ＜0.05)，以60和600 mg/kg劑量最為顯著(P＜0.01)。表明鱘魚ChS對遲發(fā)型變態(tài)反應具有促進作用。

3.4 鱘魚ChS對血清溶血素的影響

結(jié)果見表2。連續(xù)灌胃鱘魚ChS能顯著升高血清溶血素的吸光度值，且隨劑量增加呈上升趨勢。鱘魚ChS使血清溶血素升高說明其能促進CRBC抗體產(chǎn)生，并與體液免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)。

表1 鱘魚ChS對小鼠免疫器官重量指數(shù)及外周血白細胞數(shù)量的影響(n=10，x±s)Tab.1 The effects of sturgeon chondroitin sulfate on the weight of immune organs and the amount of the perivascular leukocytes in mice(n=10，x±s)

表2 鱘魚ChS對遲發(fā)型變態(tài)反應小鼠足墊腫脹度及血清溶血素的影響(n=10，x±s)Tab.2 The effects of sturgeon chondroitin sulfate on delayed-type hypersensitivity response，hemolysin and agglutinin(n=10，x±s)

圖1 鱘魚ChS對遲發(fā)型變態(tài)反應小鼠足墊腫脹度的影響Fig.1 The effects of sturgeon chondroitin sulfate on degree of swelling of ear induced by dimethylbenzene

3.5 鱘魚ChS對二甲苯誘發(fā)小鼠耳腫脹的影響

結(jié)果見表3。雄性小鼠對二甲苯致鼠耳腫脹度顯著高于雌性。同時鱘魚ChS能明顯降低雄性小鼠對二甲苯致鼠耳腫脹度，在600 mg/kg劑量最為顯著。但6和60 mg/kg劑量對雌性小鼠因二甲苯致鼠耳腫脹度無降低作用，而在600 mg/kg劑量能顯著降低雌性小鼠對二甲苯致鼠耳腫脹度。表明鱘魚ChS能顯著降低二甲苯致鼠耳腫脹度。

3.6 鱘魚ChS對蛋清致足墊炎的影響

結(jié)果見表3。鱘魚ChS 60和600 mg/kg劑量能顯著降低因蛋清致炎引起足墊腫脹度，但鱘魚ChS 6 mg/kg劑量組的足墊腫脹度與對照組差異不顯著。表明ChS對蛋清致足墊炎腫脹度有抑制作用，并與其給藥劑量有關(guān)。

4 討論

本研究證明，鱘魚ChS能提高小鼠胸腺和脾臟的器官指數(shù)，具有明顯增重作用;同時使小鼠外周血白細胞數(shù)量特別是淋巴細胞數(shù)顯著性增多并有一定的劑量濃度依賴關(guān)系。本實驗中得出的鱘魚ChS和鯊魚ChS對照品對小鼠胸腺和脾臟器官指數(shù)影響結(jié)果與戴小慧等［5］研究結(jié)果一致。

本研究證明，鱘魚ChS能明顯增加小鼠足墊腫脹度提高遲發(fā)超敏反應能力，并提升CRBC血清溶血素水平，提示鱘魚ChS能促進T淋巴細胞的活化，增強細胞免疫功能;且對機體特異性免疫功能有促進作用。推測鱘魚ChS對小鼠免疫功能的促進作用可能與免疫細胞增殖轉(zhuǎn)化和功能狀態(tài)以及一些免疫因子(如抗體、細胞因子等)水平的變化有關(guān)。其作用機制有待進一步研究。

表3 鱘魚ChS對小鼠耳過敏性腫脹度及蛋清致足墊炎腫脹度的影響(n=10，x±s)Tab.3 The effects of sturgeon chondroitin sulfate on degree of swelling of ear induced by dimethylbenzene and the swelling of foot pad induced by egg albumen(n=10，x±s)

本研究證明，鱘魚ChS能顯著降低因二甲苯致敏引發(fā)的鼠耳腫脹度及對蛋清致足墊炎腫脹度有抑制作用，表明鱘魚ChS具有抗炎抗過敏活性。

同時鱘魚ChS實驗結(jié)果與鯊魚ChS對照品的實驗結(jié)果存在相同與差異，如二者對小鼠免疫器官重量指數(shù)及外周血白細胞數(shù)量影響差異不顯著(P＞0.05);而對抑制蛋清致足墊炎腫脹度差異顯著(P＜0.05)，在提高遲發(fā)超敏反應強度存在著劑量差別。鄭江等［7-8］對這兩種ChS進行了研究并報道其紅外光譜總體基本相似，都含有乙酰氨基、羧基、硫酸基、糖環(huán)等官能團的振動峰，但鱘魚ChS的重均、數(shù)均和Z均分子質(zhì)量、比旋光度、硫酸基團含量與鯊魚ChS存在顯著差異。這表明，與鯊魚ChS相比，鱘魚ChS可能具有更好的抗炎活性和增強細胞免疫功能的作用。

近年來，鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，分離純化鱘魚ChS工藝日益成熟，成本逐漸降低，為鱘魚ChS的研究開發(fā)提供了前提條件。本文研究結(jié)果為鱘魚ChS藥用功能提供了實驗依據(jù)。

［1］陳 磊，凌沛學，賀艷麗.硫酸軟骨素和玻璃酸鈉聯(lián)合應用治療木瓜酶致兔膝骨關(guān)節(jié)炎［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(1):33-35.

［2］Tapon-Bretaudiere J，Drouet B，Matou S，et al.Modulation of vascular human endothelial and rat smooth muscle cel1 growth by a fucosylated chondroitin sulfate from echinoderml［J］.Thromb Haemost，2000，84(2):332-337.

［3］劉克為，遲·依荷巴麗，呂 靜.鯊魚軟骨素聯(lián)合化療治療晚期非小細胞肺癌療效觀察［J］.中國腫瘤臨床與康復，2009，16(2):167-169.

［4］徐永建，劉歆農(nóng)，劉慶宏，等.鯊魚軟骨素對腫瘤患者T淋巴細胞亞群的影響［J］.中國實驗血液學雜志，2001，9(1):91-96.

［5］戴小慧，章建芳，陳 龍.硫酸軟骨素免疫增強作用研究［J］.中國藥業(yè)，2006，15(16):16-18.

［6］徐傳屯，關(guān)瑞章，鄭 江，等.養(yǎng)殖鱘魚軟骨中硫酸軟骨素的優(yōu)化提取工藝研究［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(3):154-157.

［7］鄭 江，關(guān)瑞章，黃世玉.鱘魚和鯊魚硫酸軟骨素紅外光譜特性的比較研究［J］.光譜學與光譜分析，2008，28(1):106-109.

［8］鄭 江，關(guān)瑞章，黃文樹，等.鱘魚硫酸軟骨素的純化及其特性［J］.水產(chǎn)學報，2008，32(3):478-482.

［9］陳成章.免疫毒理學［M］.鄭州:鄭州大學出版社，2008:430-446.

［10］田惠光，張 兵.保健食品實用指南［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2002:18-27.