仙人掌多糖主要組分對(duì)糖尿病小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

張松蓮，趙龍巖，袁清霞，程 杰，曾富華

(1.湛江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048;2.資興市農(nóng)業(yè)局，湖南 資興 423400)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見(jiàn)的多發(fā)性?xún)?nèi)分泌代謝性疾病，其死亡率僅次于腫瘤和心血管病。DM患者的并發(fā)癥和各種感染與DM患者免疫功能低下密切相關(guān)。尤其是1型DM是一種發(fā)生于胰島β細(xì)胞的器官特異性自身免疫?。?］。從天然藥物中篩選降糖藥，已為世界各國(guó)關(guān)注。大量藥理及臨床研究表明，野生仙人掌多糖(Opuntia dillenii Haw.polysaccharides，ODPs)具有降血糖等功效，并由本實(shí)驗(yàn)室證實(shí)［2-3］，但其機(jī)理研究得較少。而研究證實(shí)多糖的免疫活性是其最重要的活性之一［4-5］。本研究建立復(fù)合型DM小鼠模型，從免疫學(xué)角度探討ODPs治療DM的機(jī)理，以期為ODPs臨床應(yīng)用及功能性食品的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

新鮮仙人掌采自湛江東海島，由湛江師范學(xué)院陳燕副教授鑒定為Opuntia dillenii Haw.。ODP-I為本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的ODPs的主要組分［3］，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量為92.44%，不含蛋白質(zhì)核酸等，微量凱氏定氮法測(cè)定總氮含量為0.152%，具有顯著降血糖活性。鏈脲佐菌素(STZ)，CALBIOCHEM公司;左旋咪唑片，廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司;綿羊紅細(xì)胞(SRBC)，金華市康大試劑公司，用時(shí)無(wú)菌吸取，按常規(guī)方法制備;注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy)，山西普德藥業(yè)有限公司;血糖檢測(cè)試劑盒，上海榮盛生物技術(shù)有限公司;NO試劑盒，南京建成生物有限公司;雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液，從市售健康雞抽取靜脈血，按常規(guī)方法制備;豚鼠血清(補(bǔ)體)，羊抗小鼠IgG，北京鼎國(guó)公司;GVB2+稀釋液、淋巴細(xì)胞分離液，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640，Gibco公司，用時(shí)加入10%小牛血清，100 u/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素，0.01 mol/L 谷氨酰胺;小牛血清，上海廣茂生物有限公司;刀豆蛋白(ConA)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，華美生物有限公司;2-巰基乙醇(2-ME)，脂多糖(LPS)，Sigma公司;二甲亞砜(DMSO)，天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;T淋巴細(xì)胞亞群試劑盒，晶美公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

TU1800S紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ANALYTECH_738 PLUS半自動(dòng)生化分析儀，上海安泰分析儀器有限公司;eppendorf臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);Bio-rad 450型酶標(biāo)儀。

1.3 動(dòng)物

健康昆明種小鼠(KM小鼠)，雄性，25～29 g，清潔級(jí)，廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn):GB14925-2001。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組和給藥

［6-7］，KM小鼠62只，隨機(jī)分組，除模型組12只外，其余各組每組10只，并按照本實(shí)驗(yàn)室方法［3］進(jìn)行管理應(yīng)用。設(shè)模型組，ODP-I低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組和正常組。除正常組外其余各組第1 天腹腔注射30 mg/kg STZ 溶液(pH 4.0，0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液配制，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，0℃保存)，第2和第3天腹腔注射60 mg/kg STZ溶液，每次注射前禁食12 h，第3次注射后48 h尾部采血測(cè)血糖濃度，以血糖值≥12 mmol/L為造模成功(血糖值＜12 mmol/L的小鼠可禁食12 h，再次腹腔注射60 mg/kg STZ溶液)，注射后48 h測(cè)血糖濃度，同時(shí)開(kāi)始灌胃給藥。低、中、高劑量組灌胃ODP-I劑量分別為100，200，400 mg/(kg·d)，模型組、正常組灌胃等量生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃30 mg/(kg·d)左旋咪唑，1次/d。灌胃給藥16 d后除正常組外均注射100 mg/kg Cy。

2.2 DM小鼠模型的評(píng)價(jià)

開(kāi)始灌胃后第8天再次測(cè)全部小鼠的血糖值。同時(shí)每天觀察小鼠飲水、攝食、排尿情況，每周稱(chēng)體重3次。記錄各組小鼠灌胃25 d內(nèi)的死亡率。

2.3 ODP-I對(duì)DM小鼠血清NO含量影響的測(cè)定

動(dòng)物分組及給藥方法同2.1項(xiàng)。灌胃25 d后，摘眼球取血處死小鼠。收集的血靜置1 h，2 500 r/min離心10 min，血清－20℃保存?zhèn)溆?。NO的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2.4 ODP-I對(duì)DM小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定

動(dòng)物分組及給藥方法同2.1項(xiàng)。灌胃22 d后，每只小鼠腹腔注射6%淀粉肉湯1.0 mL，3 d后，每只小鼠腹腔注射5%CRBC 0.2 mL。30 min后，腹腔注射生理鹽水2.0 mL，輕揉腹部邊緣，用注射器吸取腹腔液涂片，顯微鏡下計(jì)數(shù)及照相，對(duì)照片再進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算吞噬百分率。吞噬率(%)=(吞噬CRBC的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))×100%。

2.5 ODP-I對(duì)DM小鼠體液免疫功能影響的測(cè)定

動(dòng)物分組及給藥方法同2.1項(xiàng)，灌胃19 d后每鼠腹腔注射20%SRBC 0.2 mL致敏，6 d后再次注射。第26天時(shí)摘眼球取血制備血清。按照文獻(xiàn)方法［8］測(cè)定血清各型溶血素含量(Hemolysin concentration，HC)，包括 IgM溶血素(HCIgM)和 IgG溶血素(HCIgG)。

2.6 ODP-I對(duì)DM小鼠細(xì)胞免疫功能影響的測(cè)定

按2.1分組灌胃25 d后，摘眼球取血處死，分組用75%乙醇浸泡5 min，換75%乙醇再泡5 min。無(wú)菌操作取脾臟，用完全RPMI 1640培養(yǎng)液制備2.0×106個(gè)/mL的脾細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭檢測(cè)活細(xì)胞＞95%以上，備用。在超凈工作臺(tái)上，將脾細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔100 μL，共加2塊板。一塊板前3行每孔再加入 ConA 溶液10 μL(終濃度5 μg/mL)和完全RPMI 1640培養(yǎng)液90 μL，每組小鼠各做6復(fù)孔，觀察T細(xì)胞增殖反應(yīng);中間4行每孔再加入LPS溶液10 μL(終濃度10 μg/mL)和完全RPMI 1640培養(yǎng)液90 μL，每組小鼠各做8復(fù)孔，觀察B細(xì)胞增殖反應(yīng);最后一行每孔只加完全RPMI 1640培養(yǎng)液200 μL做空白對(duì)照。另一塊板每孔再加入完全RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，每組小鼠各做10復(fù)孔，并做3個(gè)復(fù)孔的空白對(duì)照，觀察小鼠淋巴細(xì)胞自然增殖反應(yīng)。將兩塊板于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中溫育72 h，用MTT法于酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。用加ConA孔的A值減去不加ConA孔的A值表示T淋巴細(xì)胞的增殖能力，用加LPS孔的A值減去不加LPS孔的A值表示B淋巴細(xì)胞的增殖能力。

外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)按2.1項(xiàng)分組灌胃25 d后摘眼球取血，按照文獻(xiàn)方法［9］操作，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用(x±s)表示，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 DM小鼠模型的評(píng)價(jià)

注射STZ 3次后48 h測(cè)血糖，66.7%小鼠血糖值＞12 mmol/L。血糖值＜12 mmol/L的小鼠禁食12 h，再一次腹腔注射60 mg/kg STZ溶液，48 h后測(cè)血糖，80%小鼠血糖值＞12 mmol/L。開(kāi)始灌胃后第8天后再次測(cè)全部小鼠的血糖值，均＞12 mmol/L，其中90%小鼠血糖值＞13 mmol/L，60%小鼠血糖值＞20 mmol/L。最后一次注射完STZ后的第7天開(kāi)始，小鼠出現(xiàn)“三多一少”癥狀。注射Cy后第3天飲水量和排尿量出現(xiàn)倒置，即模型組和低劑量組小鼠的飲水量、排尿量明顯少于中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。模型組、各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組的體重明顯小于正常組(P＜0.05)。灌胃ODP-I 25 d后，模型組和低、中劑量組小鼠精神明顯不振，患胰島炎的比率均達(dá)到80%以上，高劑量組患胰島炎的比率較低，為40%左右。正常組和高劑量ODP-I組小鼠死亡率為0，而模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和低、中劑量組小鼠死亡率分別為41.7%，20%，30%和 30%。

3.2 ODP-I對(duì)DM小鼠血清NO的影響

由表1可知，模型組NO水平顯著高于正常組(P＜0.05)。低、中、高劑量組血清NO水平低于模型組，呈量效關(guān)系。其中高劑量組血清NO水平顯著低于模型組(P＜0.05)，與正常組血清NO水平相當(dāng)。低、中劑量組血清NO水平與模型組相比，差異不顯著(P ＞0.05)。

3.3 ODP-I對(duì)DM小鼠非特異性免疫功能的影響

由表1可知，模型組比正常組吞噬率低，有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)STZ誘導(dǎo)的DM模型小鼠免疫功能低下。與模型組相比，高劑量組可極顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬CRBC的能力(P＜0.01)，有明顯的量效關(guān)系，其中高劑量組吞噬率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常組，而低劑量組吞噬率低于模型組(P＜0.01)。

3.4 ODP-I對(duì)DM小鼠血清IgM、IgG含量的影響

由表1可知，與模型組相比，各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均顯著促進(jìn)小鼠血清IgM的生成(P＜0.05)，中、高劑量組有極顯著性差異(P＜0.01)。高劑量組小鼠血清IgG的含量明顯增加，較模型組有顯著性差異(P＜0.05)，與正常組相當(dāng);而低、中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清IgG的含量與模型組相比，差異不顯著(P ＞0.05)。

表1 ODP-I對(duì)DM小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和血清NO、IgM、IgG含量的影響(± s，n=6)Tab.1 Effect of ODP-I on phagocytosis of macrophage，and serum NO，IgM and IgG levels of diabetic mice(± s，n=6)

表1 ODP-I對(duì)DM小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和血清NO、IgM、IgG含量的影響(± s，n=6)Tab.1 Effect of ODP-I on phagocytosis of macrophage，and serum NO，IgM and IgG levels of diabetic mice(± s，n=6)

與模型組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with model group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組 別 劑量/(mg/kg) NO/(μg/mL) 吞噬率/% HCIgM HCIgG正常組 － 31.4±11.11 31.12 ±6.181 392.8 ±81.32 85.0 ±22.51模型組 － 74.4±23.7 15.27 ±2.77 62.6 ±37.3 54.5 ±20.5陽(yáng)性對(duì)照組 30 39.6 ±19.2 26.32 ±14.82 195.8 ±59.62 58.0 ±20.0 ODP-I組 100 64.0 ±5.8 9.36 ±3.161 89.3 ±61.01 55.5 ±17.5 200 59.1 ±23.0 24.74 ±2.97 186.0 ±109.02 66.0 ±19.5 400 31.4 ±10.21 63.20 ±13.752 292.8 ±105.62 89.5 ±19.51

3.5 ODP-I對(duì)DM小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組、低、中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組剛分離的淋巴細(xì)胞體積增大，而高劑量組、正常組剛分離的淋巴細(xì)胞體積較小。

由表2可知，與模型組相比，中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞自然增殖能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，其中高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組和正常組達(dá)極顯著性水平(P＜0.01)。與模型組相比，各組T、B淋巴細(xì)胞增殖能力均較高，其中高劑量組均達(dá)顯著性水平(P ＜0.05)，與正常組相當(dāng)。

表2 ODP-I對(duì)DM小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of ODP-I on spleen lymphocyte proliferation of diabetic mice(± s，n=6)

表2 ODP-I對(duì)DM小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of ODP-I on spleen lymphocyte proliferation of diabetic mice(± s，n=6)

與模型組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with model group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組別 劑量/(mg/kg) 自然增殖T淋巴細(xì)胞增殖/(ConA 5 μg/mL)T淋巴細(xì)胞增殖能力B淋巴細(xì)胞增殖/(LPS 10 μg/mL)B淋巴細(xì)胞增殖能力正常組 － 0.306±0.0132 0.342 ±0.0122 0.036 ±0.0061 0.371 ±0.0222 0.065 ±0.0091模型組 － 0.213±0.024 0.239 ±0.021 0.026 ±0.005 0.243 ±0.015 0.030 ±0.009陽(yáng)性對(duì)照組 30 0.292 ±0.0182 0.324 ±0.0212 0.032 ±0.004 0.326 ±0.0112 0.034 ±0.007 ODP-I組 100 0.228 ±0.019 0.255 ±0.026 0.027 ±0.006 0.262 ±0.022 0.032 ±0.003 200 0.257 ±0.0151 0.288 ±0.0051 0.031 ±0.007 0.293 ±0.0221 0.034 ±0.006 400 0.302 ±0.0172 0.337 ±0.0292 0.035 ±0.0041 0.366 ±0.0112 0.064 ±0.0051

3.6 ODP-I對(duì)DM小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

由表3可知，本研究建立的DM動(dòng)物模型CD8+T細(xì)胞比例顯著減少，CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值顯著升高。與模型組相比，各劑量組的CD4+T細(xì)胞比例差異不顯著，CD8+T細(xì)胞比例增加，CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值下降。其中高劑量組CD4+T細(xì)胞比例、CD8+T細(xì)胞比例及CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值均與正常組相當(dāng)。

表3 ODP-I對(duì)DM小鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞的影響(± s，n=6)Tab.3 Effect of ODP-I on CD4+and CD8+T cell of peripheral blood of diabetic mice(± s，n=6)

表3 ODP-I對(duì)DM小鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞的影響(± s，n=6)Tab.3 Effect of ODP-I on CD4+and CD8+T cell of peripheral blood of diabetic mice(± s，n=6)

與模型組比較:1P＜0.05Compared with model group:1P ＜0.05

組 別 劑量/(mg/kg)CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+正常組 － 21.63±1.56 11.05±3.461 2.11±0.681模型組 － 22.73±1.86 5.53±2.00 3.37±0.86陽(yáng)性對(duì)照組 30 14.76 ±1.941 5.26 ±0.42 2.88 ±0.42 ODP-I組 100 20.02 ±0.94 6.02 ±0.54 3.35 ±0.26 200 21.39 ±3.34 7.01 ±0.27 3.07 ±0.61 400 20.50 ±1.39 10.27 ±1.521 2.02 ±0.321

4 討論

已有研究結(jié)果表明，DM患者胰島β細(xì)胞破壞主要由自身免疫性組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)制性T細(xì)胞引起，并與巨噬細(xì)胞有關(guān)。其中巨噬細(xì)胞不僅通過(guò)抗原遞呈作用介導(dǎo)DM，而且其產(chǎn)生的NO可直接發(fā)揮細(xì)胞毒作用損傷胰島β細(xì)胞。血清NO含量代表體內(nèi)NO水平，高濃度NO是損傷β細(xì)胞的終末因子［10］。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量 ODP-I可調(diào)節(jié) NO至正常水平。

單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能迅速清除多種致病物質(zhì)，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)重要系統(tǒng)。而單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM模型建立22 d后腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率明顯低于正常組，而高劑量組明顯高于正常組。但低劑量組顯著低于模型組，原因有待考察。

血清溶血實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物體液免疫的重要內(nèi)容，是體液中抗體、補(bǔ)體等免疫因子參與的免疫反應(yīng)，在免疫抗菌防病中發(fā)揮重要作用。血清IgM、IgG的含量在一定程度上能體現(xiàn)機(jī)體的體液免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)ODP-I能顯著提高IgM含量，且使其接近正常水平。高劑量組小鼠血清IgG含量也顯著增加，也與正常組相當(dāng)。

淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)是非常重要的免疫指標(biāo)，尤其T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)是反映T細(xì)胞功能和機(jī)體細(xì)胞免疫功能的主要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量ODP-I均顯著促進(jìn)了DM小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖，這可能與有絲分裂原ConA和LPS有相似的作用機(jī)制，都是對(duì)該兩種細(xì)胞的直接作用。

華覺(jué)明:傳統(tǒng)工藝是非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的重要組成部分,在國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄(四批,共1372項(xiàng))中占四分之一。振興傳統(tǒng)工藝已成為國(guó)家戰(zhàn)略,傳統(tǒng)工藝的學(xué)科建設(shè)也被提上了議事日程。在這種情勢(shì)下,有必要對(duì)傳統(tǒng)工藝的學(xué)科定位進(jìn)行明確的界定。

正常機(jī)體中各T淋巴細(xì)胞亞群相互作用，維持著機(jī)體正常的免疫功能。大量的報(bào)道提出，1型DM的發(fā)病機(jī)制包括輔助性T細(xì)胞(Th)活性增強(qiáng)和抑制性T細(xì)胞(Ts)細(xì)胞缺陷兩個(gè)方面，造成免疫調(diào)節(jié)失控和細(xì)胞因子不平衡［12-13］。與陽(yáng)性對(duì)照組不同，ODP-I主要通過(guò)上調(diào)CD8+T細(xì)胞比例，使CD4+/CD8+T細(xì)胞比值恢復(fù)正常，進(jìn)而改善DM小鼠的免疫紊亂現(xiàn)象。

本研究ODPs是由80%乙醇浸泡7～10 d的完整仙人掌莖片制得的干粉中提取得到。多糖在柱色譜進(jìn)樣及灌胃前都經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。因此可排除脂多糖污染的可能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并非細(xì)菌脂多糖污染而導(dǎo)致的假象。經(jīng)以上分析，ODP-I可通過(guò)提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，調(diào)節(jié)機(jī)體NO的產(chǎn)生，提高體液免疫功能，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖，改善T淋巴細(xì)胞亞群免疫紊亂現(xiàn)象，來(lái)增強(qiáng)DM小鼠免疫力，改善DM小鼠的癥狀，提高存活率。其免疫調(diào)節(jié)作用效果比提高免疫力的陽(yáng)性對(duì)照藥左旋咪唑好，有望作為臨床輔助藥物治療DM［14］。

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