UPLC-MS/MS測(cè)定黑小麥中B族維生素

韓 豪，李新生，2，3，高 玥，劉 新，楊智勇，馬嬌燕

(1.陜西理工學(xué)院，2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中723000)

B族維生素是一類水溶性物質(zhì)，主要包括硫胺素(維生素 B1，VB1)，核黃素(維生素 B2，VB2)和吡哆素(維生素B6，VB6)等。VB1具有醛基轉(zhuǎn)移和α-酮酸的脫羧作用，缺少它會(huì)得腳氣病、神經(jīng)性皮炎等。VB2在生物體內(nèi)起傳遞氫的作用，缺少時(shí)易患口腔炎、皮炎、微血管增生等。VB6是氨基酸轉(zhuǎn)氨基、脫羧作用，是合成神經(jīng)遞質(zhì)的必需品［1-2］。

目前B族維生素的檢測(cè)方法很多，我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法中對(duì)VB1采用熒光法，藥典中對(duì)VB1、VB6采用分光光度法［3］，國(guó)際上通用的關(guān)于 B族維生素的檢測(cè)方法大多為20多年前建立的微生物法［4］。這些方法僅能測(cè)定其中的單一組分，且步驟煩瑣，對(duì)于某些食物樣品，還要用專門的萃取方法除去干擾物后才能測(cè)定。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多種B族維生素的同時(shí)測(cè)定進(jìn)行了大量研究，建立了許多分析方法，如高效毛細(xì)管電泳法［5-6］和高效液相色譜法［7-12］。本研究建立了超高效液相-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法，高效快速檢測(cè) VB1、VB2和VB6的含量。

1 材料

5個(gè)黑小麥樣品 YK-1、YK-2、YK-3、YK-5 和YK-6，由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供。

VB1(含量98%)、VB2(含量98%)和VB6(含量100%)對(duì)照品，購(gòu)于天津一方科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純。

UPLC-MS/MS聯(lián)用儀，配電噴霧離子源(ESI)，美國(guó)Waters公司;LC-800離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司;SK-120E超聲波清洗機(jī)，寧波科生儀器廠。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相:A相為乙腈，B相為0.1%甲酸溶液，采用梯度洗脫:A 相 0～4.0 min由 95%變?yōu)?20%、4.0～7.0 min由20%變?yōu)?0%、7.0～8.0 min由80%變?yōu)?5%;流速:0.3 mL/min;分析運(yùn)行時(shí)間8 min。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI;掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);毛細(xì)管電壓:3 kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流量:650 L/h;錐孔氣流量:50 L/h。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取 VB1、VB2和 VB6對(duì)照品 1.95，1.01和2.07 mg，置25 mL量瓶中，用1%甲酸溶液溶解并稀釋至刻度，得濃度分別為78，40.28 和82.8 μg/mL的VB1、VB2和VB6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋得濃度分別為31.2，62.4，93.6，124.8 和 156 ng/mL 的 VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 32.22，64.44，96.66，128.88 和161.10 ng/mL 的 VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 16.56，33.12，49.68，66.24 和82.80 ng/mL 的 VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 定量限實(shí)驗(yàn)

分別取VB1、VB2和VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，在相同的液相質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析，以S/N=10，確定VB1、VB2和VB6的定量限。

2.5 樣品溶液制備

稱取黑小麥全粉20 g，用濾紙包好，加入石油醚150 mL，在60℃下索氏提取2 h。將脫脂后的黑小麥全粉置于50 mL棕色量瓶中，加入1%甲酸溶液50 mL，室溫下用超聲波提取20 min，冷卻后，4 000 r/min離心15 min，倒出上清液，將沉淀轉(zhuǎn)入量瓶中。重復(fù)以上步驟，再超聲提取兩次，合并三次提取液。加入淀粉酶1 mL，酶解1 h，再加入糖化酶1 mg，酶解 1 h。加 1% 甲酸溶液至 250 mL。0.2 μm過濾器過濾后，注入U(xiǎn)PLC-MS/MS儀檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先將濃度在500～1 000 ng/mL的3個(gè)維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定了VB1、VB2和VB6的分子離子［M+H］+ 為 m/z 265.93、m/z 377.06 和 m/z 170.04。然后以m/z 265.93、m/z 377.06 和 m/z 170.04 為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，在2.2項(xiàng)質(zhì)譜條件下，VB1主要有 m/z 143.97、m/z 122兩個(gè)子離子，其質(zhì)譜圖如圖1所示;VB2主要有m/z 243、m/z 172兩個(gè)子離子，其質(zhì)譜圖如圖2所示;VB6主要有m/z 134、m/z 76.96兩個(gè)子離子，其質(zhì)譜圖如圖3所示。本方法選擇豐度較高，干擾較小的離子對(duì)(m/z 265.93 ＞ 143.97，265.93 ＞ 122;377.06 ＞ 243，377.06 ＞172;170.04 ＞134，170.04 ＞76.96)作為定性離子對(duì)，選擇豐度最高的離子對(duì)(m/z 264.93＞122，377.06 ＞ 172，170.04 ＞ 76.96)作為定量離子對(duì)，在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)優(yōu)化了碰撞電壓和錐孔電壓。得到最佳錐孔電壓和碰撞電壓，如表1所示。

圖1 VB1質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of VB1

圖2 VB2質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of VB2

圖3 VB6質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of VB6

表1 最佳錐孔電壓和碰撞電壓Tab.1 The best cone voltages and collision voltages

3.2 線性范圍和定量限

以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，VB1、VB2和VB6的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為 Y=62.94 X －349.38(r=0.999 8)，Y=120.62 X+2 323.27(r=0.999 9)，Y=271.16 X+4 406.22(r=0.999 9)，在20 ～200 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，以 S/N=10，得 VB1、VB2和 VB6的定量限分別為 0.62，0.32 和 0.50 ng/mL。

3.3 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定 VB1、VB2和 VB6的峰面積，結(jié)果 VB1、VB2和VB6峰面積的 RSD(n=6)分別為0.21%，0.11%和 0.15%。

3.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取6份YK-1黑小麥樣品，按照2.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液，以上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算黑小麥(YK-1)VB1、VB2和VB6含量的RSD(n=6)分別為 0.87%，0.69% 和 0.77%，表明該方法的重復(fù)性良好。

取同一供試品溶液，在室溫下，分別于制備后0，3，6，9 和12 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果 VB1、VB2和 VB6的RSD(n=6)分別為 1.51%，1.09% 和 1.24%，表明VB1、VB2和 VB6在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知 VB1(1.792 μg/g)、VB2(0.875 μg/g)和 VB6(0.554 μg/g)含量的同一批次 YK-1黑小麥全麥粉20 g，5份，分別加入VB1(62.4 ng/mL)，VB2(32.22 ng/mL)，VB6(16.56 ng/mL)對(duì)照品溶液1 mL。按照2.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。VB1的平均回收率為97.50%，RSD為3.09%;VB2的平均回收率為 97.91%，RSD 為3.90%;VB6的平均回收率為 99.32%，RSD 為2.84%。見表 2。

表2 VB1、VB2和VB6的回收率Tab.2 Recovery of VB1，VB2and VB6

3.6 樣品含量測(cè)定

分別精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，注入U(xiǎn)PLC-MS/MS儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中VB1、VB2和VB6的含量。色譜圖見圖4～6。從表3可見，黑小麥VB1的含量為0.965 ～1.961 μg/g，黑小麥 VB2的含量為 0.614～0.963 μg/g，黑小麥 VB6的含量為 0.364 ～0.625 μg/g。不同品種黑小麥VB1、VB2和VB6的含量存在較大差異。

圖4 VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和黑小麥YK-1(B)總離子色譜圖Fig.4 Total ion current of VB1solution and black wheat(YK-1)

4 討論

小麥中B族維生素主要存在于小麥的胚芽和種皮中，小麥的胚芽和種皮中均含有脂溶性成分，而維生素為水溶性化合物，因此，黑小麥全麥粉經(jīng)脫脂后有助于維生素的提取。黑小麥全麥粉中淀粉含量較高，因此提取溫度不宜過高，否則淀粉糊化后會(huì)降低維生素的溶出率。

圖5 VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和黑小麥YK-1(B)總離子色譜圖Fig.5 Total ion current of VB2solution and black wheat(YK-1)

圖6 VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和黑小麥YK-1(B)總離子色譜圖Fig.6 Total ion current of VB6solution and black wheat(YK-1)

表3 黑小麥中VB1、VB2和VB6的含量Table.3 The content of VB1，VB2and VB6in black wheat samples

本文對(duì)溶解維生素的溶劑進(jìn)行篩選，采用50%甲醇、水、甲醇(1%甲酸)、50%甲醇(1%甲酸)、1%甲酸溶液配制VB1、VB2、VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的液相和質(zhì)譜條件下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明50%甲醇、甲醇(1%甲酸)、50%甲醇(1%甲酸)均出現(xiàn)峰拖尾的現(xiàn)象，水配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值較低，而以1%甲酸溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，響應(yīng)值最高。

在本研究中，樣品前處理過程簡(jiǎn)單、時(shí)間短，VB1、VB2和VB6在20～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;加樣回收率分別為97.50%，97.91%和99.32%。黑小麥中 VB1、VB2和 VB6的含量分別為0.965～1.961，0.614 ～0.963 和 0.364 ～0.625 μg/g。本研究為谷類作物以及食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)中VB1、VB2和VB6含量的檢測(cè)提供一種快速、高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)手段。

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