MI F含量對(duì)糖皮質(zhì)激素治療兒童支氣管哮喘療效的影響

宋玉娥 宋冬梅 張愛(ài)平

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古包頭 014010

中國(guó)2000年喘息性疾病流行病學(xué)調(diào)查顯示[1]，兒童哮喘累積患病率為0.25%～4.63%（平均1.97%）。相較1990年調(diào)查累積患病率0.11%～2.03%（平均1.00%）而言，10年內(nèi)兒童哮喘患病率平均上升了64.8%。支氣管哮喘是一種以血清IgE增高、肺組織嗜酸性粒細(xì)胞侵潤(rùn)、黏液高分泌和氣道高反應(yīng)為顯著特征的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。作為兒科最常見(jiàn)疾病之一，它嚴(yán)重地影響了兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和身心健康。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明[2]，MIF可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展等病理生理過(guò)程。它的促炎反應(yīng)活性常和促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-c、黏附因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)聯(lián)系在一起。MIF是一種高度多變的蛋白質(zhì)，它既是一種前炎癥因子、神經(jīng)內(nèi)分泌激素和酶，同時(shí)還可以作為糖皮質(zhì)激素（GC）生理活動(dòng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。在治療支氣管哮喘的抗炎藥物中，糖皮質(zhì)激素又是最為有效的藥物。相關(guān)研究已經(jīng)證明糖皮質(zhì)激素是通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合，進(jìn)而抑制前炎癥介質(zhì)和有關(guān)細(xì)胞因子的釋放而發(fā)揮其抗炎作用的[3]。且有最新研究表明MIF是目前惟一被認(rèn)為能夠負(fù)向調(diào)節(jié)GC的抗炎作用的細(xì)胞因子[4]，MIF 可以減弱 GC 對(duì) IL-1（白介素-1）、IL-6、IL-8 和 TNF-α（腫瘤壞死因子）等多種細(xì)胞因子分泌的抑制作用，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[2]。選取2009年11月—2011年12月內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科門診及病房治療的100例支氣管哮喘急性發(fā)作期患者進(jìn)行研究，該研究通過(guò)測(cè)定外周學(xué)MIF的含量，來(lái)探討其對(duì)糖皮質(zhì)激素治療兒童支氣管哮喘療效的影響并評(píng)價(jià)其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

100 例急性期患者中男56例，女44例，平均年齡（3.7±2.5）歲。隨機(jī)抽取53例患者進(jìn)行隨訪，指導(dǎo)其規(guī)律霧化吸入糖皮質(zhì)激素，其中失訪3例，有效隨訪50例，隨訪的支氣管哮喘患兒組中經(jīng)過(guò)規(guī)律治療40 d后仍然有咳嗽和或治療過(guò)程中出現(xiàn)反復(fù)喘息的患兒有12例，作為反復(fù)發(fā)作組病例；而支氣管哮喘患兒組中經(jīng)過(guò)規(guī)律治療40 d后無(wú)咳嗽，治療過(guò)程中未出現(xiàn)反復(fù)喘息的患兒有38例，作為未反復(fù)發(fā)作組病例。

入選標(biāo)準(zhǔn)：符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡0～14歲，不伴其他感染性及免疫性疾病。且所有急性期患者近4個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)激素和免疫調(diào)節(jié)劑。

治療方案：第1周，應(yīng)用布地奈德混懸液1 mg霧化泵吸入,3次/d；第2周，應(yīng)用布地奈德混懸液1 mg霧化泵吸入,2次/d；第3、4周，應(yīng)用布地奈德混懸液0.5 mg加生理鹽水1 mL霧化泵吸入，3次/d；第 5、6周應(yīng)用布地奈德混懸液 0.5 mg加生理鹽水1 mL霧化泵吸入，2次/d，霧化14 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集及保存 支氣管哮喘急性發(fā)作期患者留取空腹靜脈血 2 mL，1 500 r/min離心10 min，分別提取上層血清，分裝至200 μL EP管中，置于-70℃冰箱保存。

1.2.2 測(cè)定步驟 MIF檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于美國(guó)R&D System公司，采用酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme-linked imunosorbent assay,ELISA）測(cè)定。（1）從冰箱內(nèi)取出待測(cè)樣品，平衡至室溫；（2）取出試劑盒，室溫放置30 min。（3）取出酶標(biāo)板依次編號(hào)，并設(shè)空白孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔。（4）加樣：①空白孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗MIF抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；②標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50 uL,鏈霉素-HRP 50 uL；③待測(cè)樣品孔：加入樣本40 uL，然后加入抗-MIF抗體10 uL、鏈霉素-HRP 50 uL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育 60 min。（5）配液：將30倍的濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。（6）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。（7）顯色：每孔加入顯色劑A50 uL,再加入顯色劑B 50 uL,輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。（8）終止：每孔加入終止液50 uL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色）。（9）測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定在加終止液后10 min內(nèi)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，反復(fù)發(fā)作組支氣管哮喘患兒（反復(fù)發(fā)作組）有12例，這12例患兒的MIF含量明顯高于未反復(fù)發(fā)作組支氣管哮喘患兒的 MIF 含量（F=0.71134，P=0.000，P<0.05）（見(jiàn)表 1，圖1）。

表1 兩組患兒急性期檢測(cè)外周血MIF結(jié)果比較

圖1 兩組支氣管哮喘患兒急性期MIF含量比較

3 討論

支氣管哮喘作為一種氣道慢性炎癥性變態(tài)反應(yīng)性疾病，目前其最為有效的治療藥物仍然是GC。而相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，MIF和GC在細(xì)胞表面受體及細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)水平上具有相互作用[5]。MIF作為目前惟一被認(rèn)為能夠負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的細(xì)胞因子，其主要作用機(jī)制包括[6-7]：①抑制了MKP-1(蛋白激酶磷酸酶-1)的表達(dá)；②激活 cPLA(胞漿型磷脂酶 A)；③抑制 NF-κB（核因子κB）；④與 COP9信號(hào)小體調(diào)節(jié) IxBa相關(guān)；⑤其他作用機(jī)制。Roger等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MIF以自分泌的方式通過(guò)對(duì)MKP-1誘導(dǎo)表達(dá)而負(fù)向調(diào)節(jié)了GC抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，并指出MIF在巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮必須作用。由于MIF對(duì)GC的抗炎作用有顯著拮抗作用，一部分學(xué)者認(rèn)為MIF與支氣管哮喘患者對(duì)GC的耐藥性有關(guān)。國(guó)外學(xué)者Sabroe等[9]通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)在激素抵抗型哮喘患者外周血中MIF呈高表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)了MIF與哮喘患者激素抵抗的發(fā)病有相關(guān)性。國(guó)內(nèi)學(xué)者陳培芬、羅雅玲等[10]對(duì)哮喘小鼠研究發(fā)現(xiàn)，MIF在氣道重塑小鼠肺中高表達(dá)，而研究證實(shí)氣道重構(gòu)是持續(xù)難治性哮喘的顯著特征，故氣道重塑中MIF的表達(dá)可能減弱了GC敏感性，與持續(xù)難治性哮喘有關(guān)。

該研究結(jié)果顯示，反復(fù)發(fā)作組患兒外周血中MIF含量顯著高于未反復(fù)發(fā)作組，提示MIF的存在減弱了GC的敏感性，對(duì)GC治療支氣管哮喘療效有顯著影響。且陳培芬等[7]研究發(fā)現(xiàn)MIF在氣道重塑小鼠肺中高度表達(dá)，提示MIF與氣道重塑密切相關(guān)，而氣道重塑是不可逆性的，它是成人持續(xù)難治性哮喘的顯著特征。該實(shí)驗(yàn)中反復(fù)發(fā)作組患兒外周血中MIF顯著增高，進(jìn)而我們推測(cè)此類患兒發(fā)生氣道重塑可能性大于未反復(fù)發(fā)作組患兒，他們將來(lái)極有可能轉(zhuǎn)為成人哮喘，故外周血MIF可作為判斷支氣管哮喘患兒預(yù)后的指標(biāo)之一。

[1]全國(guó)兒童哮喘協(xié)助組.2000年與1990年兒童支氣管哮喘患病率的調(diào)查比較[J].中華結(jié)核與呼吸雜志,2004(2):112-116.

[2]Clark NM,Goog M,Clork MA,et al.Loog term effects of Asthma eclucation for physicians on patient satisfaction and use of health services[J].Eur Respir J,2000（16）:15-21.

[3]崔娜,劉大為.糖皮質(zhì)激素在嚴(yán)重感染和感染性休克中的應(yīng)用[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2005,17(4):241-243.

[4]Nishihira J.Macrophage migration inhibitory factor(MIF):its essentialrole in the immune system and cell growth[J].J Inteferon Cytokine Res,2000（20）:751-762.

[5]Calandra T,Bernhagen J,Metz CN,et al.MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production[J].Nature,1995,377(6544):68-71.

[6]Kobayassh IM,Nasuhaya Y,Kamachi A,et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in ovalbumin-induced air way inflammation in rats[J].EurRespir J,2006,27(4):726-734.

[7]Mizue Y,Glumi s,Leng L,et al.Role for maerophage migration inhibitory factor in asthma[J].Proe Nail Aead Sci USA,2005,102(40):14410-14415.

[8]Roger T,Chanson AL,KnaupReymond M,et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes innate immune responses by suppressing glucocorticoid-induced expression of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1[J].Eur J Immunol,2005,35(12):3405-3413.

[9]Sabroe I,Pease JE,Williams TJ.Asthma and MIF:innately Th1 and Th2[J].Clin Exp Allergy,2000(30):1194-1196.

[10]陳培芬,羅雅玲,賴文巖,等.慢性哮喘小鼠肺組織巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)及地塞米松對(duì)其的調(diào)節(jié)[J].廣東醫(yī)學(xué),2009,30(3):338-341.