神經(jīng)肽類(lèi)似物DOTA－Substance P的177Lu標(biāo)記及其生物分布

梁積新，李洪玉，向?qū)W琴，羅洪義，胡連生，鄧新榮，陳 陽(yáng)，莊 玲，羅志福

（1.中國(guó)原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.核工業(yè)北京401醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 102413）

Substance P（P物質(zhì)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)SP）是一種含有11個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽，其氨基酸序列為：Arg－Pro－Lys－Pro－Gln－Gln－Phe－Phe－Gly－Leu－Met－NH2。SP主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化道內(nèi)，心血管中亦有廣泛分布。當(dāng)神經(jīng)受刺激后，SP可在中樞端和外周端末梢釋放，與神經(jīng)激肽－1（NK－1）受體結(jié)合發(fā)揮生理作用。它對(duì)多種生理活動(dòng)有促進(jìn)作用，除作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)和內(nèi)分泌或旁分泌因子起作用外，還可能參與其他生理過(guò)程［1］。

177Lu是一種核性質(zhì)較為理想，可用于腫瘤放射性治療的放射性核素。177Lu的半衰期為6.7d，發(fā)射的β－粒子的平均能量為133keV，在組織中平均射程為670μm，適合殺死腫瘤組織，除β－射線外，還發(fā)射能量為113keV和208keV的γ射線，可用于顯像監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)治療過(guò)程，起到“一藥兩用”的作用［2－3］。

胰腺癌屬于神經(jīng)內(nèi)分泌瘤，是致死率高的一類(lèi)腫瘤，其五年存活期僅為3%～5%。石欣等［4］研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中NK－1受體蛋白有過(guò)度表達(dá)。利用SP與NK－1的親和性，將放射性核素引入SP分子中，利用SPECT技術(shù)可以對(duì)胰腺腫瘤進(jìn)行顯像，獲取腫瘤定位、大小等信息，對(duì)腫瘤治療方案的制定提供參考［5］。

Pujatti等［6］對(duì)177Lu－DOTA－SP 在 胰 腺 癌AR42J模型裸鼠中的生物行為進(jìn)行了初探，發(fā)現(xiàn)該藥物在AR42J胰腺癌細(xì)胞中有一定的攝取。

本研究旨在建立177Lu標(biāo)記神經(jīng)肽類(lèi)似物DOTA－SP的方法以及177Lu－DOTA－SP的質(zhì)控分析方法，并進(jìn)行標(biāo)記物在正常小鼠與PANC－1模型裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)行為研究，探討177Lu－DOTA－SP用于人胰腺癌PANC－1的腫瘤顯像及放射性治療的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

DOTA－SP：IAEA 提供，純度大于95%；177LuCl3溶液：以富集176Lu2O3（豐度為82.8%）為靶材，在中國(guó)原子能科學(xué)研究院49－2反應(yīng)堆內(nèi)輻照，經(jīng)化學(xué)處理后得到，放射性比活度88.8～111.0TBq／g（2.4～3.0Ci／mg）；乙腈：色譜純，比利時(shí)Acros公司產(chǎn)品；三氟乙酸（TFA）：生化級(jí)，比利時(shí)Acros公司產(chǎn)品；ITLCSG：Gelman Sciences公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ水。

HPLC系統(tǒng)：美國(guó)Varian公司；HPLC放射性檢測(cè)器：德國(guó)Raytest公司；BS124S電子天平：德國(guó)Sartorius公司；N2－522E.CAM 雙探頭SPECT：德國(guó)西門(mén)子公司；FH463A自動(dòng)定標(biāo)器、FT－603 型閃爍探頭：北京核儀器廠；CRC15R放射性活度計(jì)：美國(guó)Capintec公司；Mili－Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠：雌性，28只，20±2g，清潔級(jí)，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

PANC－1人胰腺癌裸鼠：12只，購(gòu)于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。采用瘤塊接種方式，將PANC－1人胰腺癌腫瘤組織移植到Balb／c－nu裸鼠的右前腿皮下，將種植了腫瘤的裸鼠正常飼養(yǎng)兩周，腫瘤直徑長(zhǎng)至約1cm時(shí)用于模型裸鼠的體內(nèi)分布和SPECT顯像實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DOTA－SP的177Lu標(biāo)記

取0.1mL DOTA－SP水溶液 （含 DOTASP 20～30μg）加入干凈Eppendorf管中，再加入0.1mL 0.4mol／L醋酸鈉－龍膽酸緩沖溶液和0.1mL177LuCl3溶液（放射性活度約為185MBq）。用1mol／L NaOH 溶液調(diào) pH 約4.5，搖勻，于90℃下反應(yīng)30min。

2.2 177Lu－DOTA－SP的質(zhì)控分析

177Lu－DOTA－SP的標(biāo)記率和放化純度采用快速薄層層析法（ITLC）和高效液相分析法（HPLC）進(jìn)行分析。ITLC的分析條件為：ITLC－SG為支持體，0.1mol／L檸檬酸鈉溶液為展開(kāi)劑。HPLC色譜條件為：C18色譜柱（Hypersil ODS2，φ4.6mm×250mm）；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220nm；流速為1mL／min；溶劑 A為0.1%TFA的水溶液，溶劑B為0.1%TFA的乙腈溶液。采用梯度洗脫：0～3min 0%溶劑B，3～25min 0～90% 溶劑B，25～30min 90%溶劑B，30～35min 90%～0溶劑B。

2.3 標(biāo)記物的純化

采用Sep－Pak固相萃取法純化標(biāo)記產(chǎn)物：將反應(yīng)液加載到分別用甲醇和水預(yù)活化過(guò)的C18 Sep－Pak柱上，先用10mL水將游離的177LuCl3洗脫，再用3～5mL甲醇將177Lu－DOTA－SP洗脫下來(lái)并收集，用N2吹干，用適量體積的生理鹽水溶解，備用。

2.4 177Lu－DOTA－SP的體外穩(wěn)定性研究

2.4.1 生理鹽水中的穩(wěn)定性 將2.3節(jié)所得177Lu－DOTA－SP的生理鹽水溶液于室溫下放置，并于不同時(shí)間間隔取樣，用ITLC層析法和HPLC色譜法確定其放化純度，分析條件與2.2節(jié)相同。

2.4.2 小牛血清中的穩(wěn)定性 取0.1mL2.3節(jié)所得177Lu－DOTA－SP溶液，加入0.9mL 5%或10%小牛血清中，混勻，于37℃下溫育。分別于30min，1、2、3、4h取0.1mL混合液，加0.1mL乙腈溶液，渦旋混勻，離心，取上清液，用ITLC層析法和HPLC色譜法確定其放化純度，分析條件與2.2節(jié)相同。

2.5 177Lu－DOTA－SP 在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

取28只昆明種雌性小白鼠，隨機(jī)分為7組，每組4只，經(jīng)尾靜脈注射0.1mL純化后的177Lu－DOTA－SP（0.37MBq），分別于給藥后15、30min，1、2、4、24、48h斷頭處死，取血、心、肝、脾、腎、肺、胃等臟器稱(chēng)重，并測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的放射性攝取率（%ID／g）。

2.6 177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌 PANC－1模型裸鼠體內(nèi)的生物分布及SPECT顯像

PANC－1人胰腺癌模型裸鼠9只，隨機(jī)分為3組，每組3只，經(jīng)尾靜脈注射0.1mL177Lu－DOTA－SP（0.26MBq）溶液，于給藥后1、2、4h斷頭處死，取腫瘤、血、心、肝、脾、腎、肺、胃以及其他感興趣臟器稱(chēng)重，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的放射性攝取率（%ID／g）。

用于SPECT顯像的模型動(dòng)物裸鼠3只，每只 尾 靜 脈 注 射 0.1mL177Lu－DOTA－SP（1.11MBq），分別在給藥后30、60、90、120min進(jìn)行顯像。

顯像時(shí)，177Lu能窗采用113keV，顯像數(shù)據(jù)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)256×256矩陣中進(jìn)行記錄與分析。放大倍數(shù)為1，每只動(dòng)物采集放射性計(jì)數(shù)為35 000。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 177Lu－DOTA－SP的制備

以DOTA為雙功能螯合劑，實(shí)現(xiàn)了放射性治療核素177Lu對(duì)神經(jīng)肽類(lèi)似物小分子肽SP的標(biāo)記。在優(yōu)化條件下（DOTA－SP用量為20～30μg，pH＝4.5，90 ℃ 下反應(yīng)30min），DOTA－SP的177Lu標(biāo)記率＞90%。SP為具有生物活性的小分子肽，其標(biāo)記通常需要高比活度放射性核素［7］，為了避免在標(biāo)記過(guò)程帶入其他金屬的污染，在操作過(guò)程中，一定小心避免引入金屬雜質(zhì)。通常說(shuō)來(lái)，DOTA是一種絡(luò)合能力很強(qiáng)的雙功能螯合劑。然而，標(biāo)記率僅為90%，可能的原因是177Lu放射性比活度不夠高，大量載體176Lu 與 DOTA－SP 競(jìng) 爭(zhēng) 結(jié) 合，從 而 影 響DOTA－SP的177Lu標(biāo)記率。

在上述ITLC 分析體系中，177Lu－DOTA－SP停留在原點(diǎn)，其Rf為0.0～0.1，177LuCl3則隨溶劑移到前沿，其Rf為0.9～1.0。

177Lu－DOTA－SP的HPLC分析圖譜示于圖1。由圖1可以看出，177Lu－DOTA－SP的保留時(shí)間為（17.6±0.1）min，而游離177LuCl3的保留時(shí)間為（4.6±0.1）min。

經(jīng) Sep－Pak 柱 固 相 萃 取 純 化 后，177Lu－DOTA－SP的放化純度＞98%。

圖1 177Lu－DOTA－SP的HPLC圖譜

3.2 177Lu－DOTA－SP的體外穩(wěn)定性

177Lu－DOTA－SP的體外穩(wěn)定性分別示于圖2和圖3。圖2結(jié)果顯示，177Lu－DOTA－SP在生理鹽水中有良好的穩(wěn)定性，于室溫下放置9d，標(biāo)記物放化純度仍大于95%。圖3結(jié)果顯示，177Lu－DOTA－SP在5%小牛血清中有較好的穩(wěn)定性，溫育2h后，其放化純度仍尚大于95%，溫育4h后，下降到92.3%；177Lu－DOTA－SP與濃度較高的血清（10%）競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)，其降解稍快，溫育4h后，放化純度下降到84.9%。

圖2 177Lu－DOTA－SP在生理鹽水中的穩(wěn)定性

圖3 177Lu－DOTA－SP在小牛血清中的穩(wěn)定性◆——5%血清；■——10%血清

3.3 177Lu－DOTA－SP的體內(nèi)生物分布

177Lu－DOTA－SP在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1可知，177Lu－DOTA－SP在正常小鼠的體內(nèi)生物分布呈以下特點(diǎn)：標(biāo)記物血清除快，在給藥15min時(shí)，血中放射性攝取為（4.63±0.80）%ID／g，而在給藥2h時(shí)，降為（0.80±0.12）%ID／g；腎放射性攝取高，在給藥2h后腎攝取達(dá)到峰值，為（37.24±3.73）%ID／g，且滯留時(shí)間長(zhǎng)，給藥48h后，仍高達(dá)（15.02±4.97）%ID／g，提示標(biāo)記物在體內(nèi)的代謝途徑主要是腎臟。標(biāo)記物在骨骼中有一定放射性攝取，且滯留時(shí)間長(zhǎng)，這與游離177Lu的親骨性有關(guān)。

表1 177Lu－DOTA－SP在正常小鼠體內(nèi)的生物分布（±s，n＝4）

表1 177Lu－DOTA－SP在正常小鼠體內(nèi)的生物分布（±s，n＝4）

組織或器官放射性攝取率／（%ID·g－1）15min 30min 1h 2h心2.14±0.29 1.78±0.38 1.08±0.05 0.97±0.09肝 2.20±0.13 3.02±0.42 2.99±0.12 2.99±0.47脾 1.64±0.15 2.72±0.63 2.09±0.25 2.45±0.94肺 3.69±0.97 3.51±0.50 2.11±0.30 1.19±0.06腎 20.41±3.03 33.89±4.23 33.95±1.91 37.24±3.73血 4.63±0.80 3.71±0.85 1.39±0.21 0.80±0.12胰腺 1.93±0.31 1.91±0.81 1.11±0.07 0.72±0.08胃 2.64±0.52 2.84±0.84 1.88±0.18 1.36±0.26腸 4.08±0.70 3.34±1.48 2.44±0.93 1.80±0.18股骨 3.17±0.22 3.92±0.76 3.30±0.21 3.13±0.29肌肉 1.30±0.14 1.21±0.28 0.56±0.04 0.49±0.05組織或器官放射性攝取率／（%ID·g－1）4h 24h 48h心0.82±0.06 0.71±0.10 0.66±0.02肝 3.08±0.17 2.21±0.16 1.47±0.65脾 2.40±1.02 1.67±0.18 1.30±0.39肺 1.12±0.37 0.60±0.16 0.56±0.28腎 33.32±2.56 27.83±3.30 15.02±4.97血 0.51±0.05 0.20±0.02 0.18±0.06胰腺 0.79±0.10 0.59±0.05 0.58±0.07胃 1.09±0.18 0.81±0.04 0.70±0.13腸 1.83±0.57 1.34±0.18 0.82±0.39股骨 3.19±0.41 3.08±0.38 2.65±0.54肌肉0.50±0.08 0.34±0.05 0.33±0.06

3.4 177Lu－DOTA－SP 在人胰腺癌 PANC－1模型裸鼠的體內(nèi)分布

177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌 PANC－1模型裸鼠體內(nèi)的生物分布列于表2。

表2 177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌PANC－1模型裸鼠體內(nèi)的生物分布（±s，n＝3）

表2 177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌PANC－1模型裸鼠體內(nèi)的生物分布（±s，n＝3）

組織或器官放射性攝取率（%ID·g－1）1h 2h 4h心1.01±0.09 0.77±0.10 0.80±0.03肝 0.66±0.15 0.56±0.01 0.38±0.24脾 1.56±0.61 1.20±0.16 1.14±0.25肺 1.13±0.06 0.63±0.19 0.70±0.18腎 4.89±1.09 4.05±0.15 3.07±1.97胰腺 0.80±0.06 0.58±0.03 0.78±0.21胃壁 1.96±0.09 1.25±0.24 1.03±0.34小腸 5.20±0.89 3.61±0.80 2.14±1.68肌肉 0.66±0.10 0.46±0.12 0.51±0.11股骨 2.18±0.44 1.74±0.16 2.39±0.73血 0.67±0.16 0.28±0.06 0.27±0.11腫瘤3.34±1.67 1.76±0.36 1.35±0.63

由表2可知，給藥1h時(shí)，177Lu－DOTA－SP在腫瘤中有相當(dāng)高的放射性攝取，為（3.34±1.67）%ID／g，在給藥后4h，腫瘤中仍有一定放射性攝取，為（1.35±0.63）%ID／g。人胰腺癌PANC－1中放射性攝取在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)均高于正常胰腺細(xì)胞中的放射性攝取，提示在PANC－1腫瘤細(xì)胞中存在NK－1受體。

177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌模型裸鼠中的SPECT圖像采集選取了4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（0.5、1、1.5、2h）。其中0.5和1h時(shí)的SPECT圖像示于圖4。由圖4可以看出，177Lu－DOTA－SP在PANC－1人胰腺癌中并沒(méi)有明顯濃集?？赡艿脑蚴?，對(duì)于放射性金屬核素標(biāo)記的多肽類(lèi)藥物來(lái)說(shuō)，放射性核素的比活度是影響藥物體內(nèi)代謝性質(zhì)的重要因素［8］。由于本實(shí)驗(yàn)中用于177Lu－DOTA－SP制備的177Lu 的比活度不夠 高，載體176Lu的大量存在影響到177Lu－DOTA－SP 的體內(nèi)性質(zhì)，從而也影響腫瘤對(duì)藥物的攝?。?］。

圖4 177Lu－DOTA－SP在PANC－1人胰腺癌模型裸鼠中的SPECT顯像

4 結(jié) 論

采用177Lu標(biāo)記神經(jīng)肽類(lèi)似物DOTA－SP的標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，標(biāo)記物177Lu－DOTA－SP顯示了良好的體外穩(wěn)定性。177Lu－DOTA－SP 在血液中清除快；腎中放射性攝取高，提示標(biāo)記物在體內(nèi)的排泄途徑主要是泌尿系統(tǒng)。體外穩(wěn)定性和體內(nèi)生物學(xué)分布特點(diǎn)顯示了177Lu－DOTA－SP良好的 藥 物 性 質(zhì)。177Lu－DOTA－SP 在 人 胰 腺 癌PANC－1模型小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果顯示，腫瘤對(duì)標(biāo)記物有一定攝取，然而，SPECT顯像結(jié)果顯示，177Lu－DOTA－SP 在 PANC－1人胰腺癌腫瘤中無(wú)明 顯 濃 集。177Lu－DOTA－SP 能 否 應(yīng) 用于胰腺癌腫瘤顯像與治療尚需進(jìn)一步研究。

致謝：對(duì)鄭德強(qiáng)和孫桂全同志在實(shí)驗(yàn)中提供的幫助表示衷心感謝！

［1］ Datar P，Srivastava S，Coutinho E，et al.Substance P：Structure，function and therapeutics［J］.Current Topics in Medicinal Chemistry，2004，4：1 075－1 103.

［2］ Dvorakova Z，Henkemann R，Lin X，et al.Production of177Lu at the new research reactor FRM－Ⅱ：Irradiation yield of176Lu（n，γ）177Lu［J］.Ap－plied Radiation and Isotope，2008，66：147－151.

［3］ Pillai MRA，Chakraborty S，Das T，et al.Production logistics of177Lu for radionuclide therapy［J］.Applied Radiation and Isotopes，2003，59：109－118.

［4］ 石欣，裴斐，高乃榮，等.P物質(zhì)及其受體在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2003，20：166－167.

［5］ Breeman WAP，Hagen MP，Visser－Wisselaar HA，et al.In vitro and in vivo studies of substance P receptor expression in rats with the new analog［Indium－111－DTPA－Arg1］Substance P［J］.The Journal of Nuclear Medicine，1996，37：108－117.

［6］ Pujatti PB，Barrio O，Caldeira J，et al.Radiola－beling of substance P with177Lu and in vivo evaluation of tumor cell uptake in nude mice：Preliminary results［J］.The Journal of Nuclear Medicine，2008，49（Suppl 1）：437.

［7］ Okarvi S.Peptide－based radiopharmaceuticals and cytotoxic conjugates：Potential tools against cancer［J］.Cancer Treatment Reviews，2008，34：13－26.

［8］ Breeman WAP，Jong M，Visser TJ，et al.Optimising conditions for radiolabeling of DOTA－peptides with90Y，111In and177Lu at high specific activities［J］.European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging，2003，30：917－920.