骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏鎮(zhèn)痛及對免疫性關(guān)節(jié)炎試驗研究

孫明江 楊 光 肖艷芳 譚 穎 呂旭瀟 孫 超

(1山東中醫(yī)藥大學，250355;2濰坊市立醫(yī)院)

1 試驗材料

1.1 試驗藥物 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏由鹿角霜、葛根、威靈仙、羌活、狗脊、川續(xù)斷、虎杖、川牛膝等構(gòu)成。功效主治為溫腎填精，祛風除濕、化瘀消積、舒筋通絡(luò)。主治骨痹，證屬腎精不足、寒濕痹痛者。癥見頸項僵痛，或肩背沉緊疼痛，眩暈，活動不利，肢端麻木竄痛，痿弱少力等。用法用量:外用，貼患處。每日1～2帖。大劑量組:根據(jù)試驗要求特別制備，濃度(生藥含量)為臨床濃度的2倍，每貼含生藥量為7.24g。中劑量組:濃度為臨床濃度，每貼含生藥量3.62g。小劑量組:為根據(jù)試驗要求特別制備，該濃度為臨床濃度的50%。每貼含生藥量1.81g。陰性對照藥:骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏基質(zhì)組(以下簡稱基質(zhì)組)，由制備骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏基質(zhì)組成，不含任何藥物。以上均由山東中醫(yī)藥大學藥學院提供。陽性對照藥:麝香壯骨膏，批號20110304，濟南衛(wèi)生材料廠。卡介苗:蘭州生物制品研究所生產(chǎn)，批號:20090208。

1.2 試驗動物 昆明種小鼠(SPF級)，體重18～22g;wistar大鼠(SPF級)，雌雄兼有，由山東大學試驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(魯)20030004。飼料:試驗鼠全價顆粒飼料，由山東省動物中心提供，執(zhí)行標準:GB19424-94。飼養(yǎng):常規(guī)飼養(yǎng)，室溫控制在22～26℃，動物使用許可證號SYXK(魯)20050043。

1.3 試驗器材 JA5003A電子天平:上海電子天平儀器廠。OLYMPUS顯微鏡，日本產(chǎn)。熱板儀:山東醫(yī)學科學院。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對熱板所致小鼠痛閾的影響

挑選雌性小鼠，體重18～22g，在熱板儀上(溫度55℃)挑選痛閾值(舔后足時間)合格的小鼠(痛閾值為5～30s)，共挑選100只，根據(jù)痛閾值隨機分為5組，每組20只，分別為基質(zhì)組、小劑量組、中劑量組、大劑量組以及陽性對照藥麝香壯骨膏組。分別于給藥前24h在小鼠臀部脫毛，于脫毛區(qū)貼上相應的膏藥，給藥面積皆為1cm×1cm，分別于給藥后24h、48h測定小鼠痛閾值，并計算提高百分率。結(jié)果見表1。從試驗可以看出，骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏能夠提高小鼠的痛閾值，藥后24h與基質(zhì)對照組比較，各劑量組都具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);藥后48h與基質(zhì)對照組比較，小劑量、中劑量組具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，大劑量組具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且大劑量組與麝香壯骨膏組比較也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨劑量的增加痛閾值明顯提高;抑制百分率隨劑量的增加也相應提高。

表1 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對熱板所致小鼠疼痛的影響(±s)

表1 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對熱板所致小鼠疼痛的影響(±s)

注:與基質(zhì)對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與陽性對照組比較，△P ＜0.05。

組別 痛閾值(秒)給藥前 藥后24h 提高(%) 藥后48h 提高(%)14.7 ±91 12.7 ±7.0 - 14.6 ±10.6小劑量組 15.5 ±5.9 19.1 ±12.1* 50.4 22.8 ±14.0* 56.2中劑量組 14.1 ±6.8 21.8 ±14.3* 71.7 23.7 ±16.3* 62.3大劑量組 15.1 ±7.1 22.6 ±15.4* 80.0 28.6 ±15.2＊＊△ 95.9陽性對照組 14.7 ±7.2 17.4 ±7.5*基質(zhì)對照組37.0 15.6 ±9.0 6.8

2.2 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對醋酸所致小鼠扭體的影響

取昆明種小鼠100只，雌雄各半，隨機分成基質(zhì)組、小劑量組、中劑量組、大劑量組以及陽性對照藥麝香壯骨膏組。給藥方法同前，分別于給藥后24h腹腔注射0.6%醋酸，每10g體重注射0.1mL。記錄各鼠首次出現(xiàn)扭體時間(潛伏期)及計數(shù)20min內(nèi)扭體次數(shù)，并計算抑制率。試驗結(jié)果見表2。從試驗可以看出:骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏給藥24h，能夠延長小鼠的疼痛潛伏期，由基質(zhì)組的3.72min，大劑量組延長至 4.57min，與基質(zhì)對照組比較中劑量具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，大劑量組具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，潛伏期的延長符合較明顯的量效關(guān)系;藥后24h小鼠20min內(nèi)扭體次數(shù)減少，與基質(zhì)對照組比較，小劑量、中劑量都有降低的趨勢，但統(tǒng)計學未見明顯的差異，大劑量組與之比較，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，疼痛抑制率，大劑量組可提高24.7 %。

表2 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏給藥24h對醋酸所致小鼠扭體的影響(±s)

表2 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏給藥24h對醋酸所致小鼠扭體的影響(±s)

注:與基質(zhì)對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

內(nèi)扭體次數(shù) 抑制率基質(zhì)對照組組別 潛伏期(分) 20min 3.72 ±0.95 44.1 ±15.8 -小劑量組 4.26 ±0.80 37.7 ±12.5 14.5中劑量組 4.57 ±1.06* 35.5 ±17.3 19.5大劑量組 4.57±0.86＊＊ 33.2±11.3* 24.7陽性對照組3.84 ±1.13 38.3 ±19.3 13.2

另取小鼠100只，雌雄各半，隨機分成基質(zhì)組、小劑量組、中劑量組、大劑量組以及陽性對照藥麝香壯骨膏組，給藥方法同前，給藥后24h重新?lián)Q藥1次。于第2次給藥后24h腹腔注射0.6%醋酸，試驗方法同前。試驗結(jié)果見表3。從試驗可以看出:骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏連續(xù)給藥 48h，小鼠的疼痛潛伏期，由基質(zhì)組的4.62min延長至6.58min(大劑量組)，隨劑量的增加潛伏期明顯延長，與基質(zhì)對照組比較中劑量組具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，大劑量組具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，符合一定的量效關(guān)系。從扭體次數(shù)上看，藥后48h與基質(zhì)組比較，20min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)明顯減少，中劑量、大劑量組與基質(zhì)組比較，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，小劑量組有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學意義，疼痛抑制率中劑量為 24.5%，大劑量組可提高至26.1%。

表3 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏給藥48h對醋酸所致小鼠扭體的影響(±s)

表3 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏給藥48h對醋酸所致小鼠扭體的影響(±s)

注:與基質(zhì)對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

內(nèi)扭體次數(shù) 抑制率基質(zhì)對照組組別 潛伏期(分) 20min 4.62 ±1.87 44.5 ±16.1 -小劑量組 5.32 ±1.20 37.7 ±12.8 15.3中劑量組 6.26 ±2.01* 33.6 ±11 24.5大劑量組 6.58±2.05＊＊ 32.9±10.2 26.1陽性對照組5.72 ±1.79 35.9 ±15.1 19.3

2.3 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對免疫性關(guān)節(jié)炎的影響

2.3.1 佐劑的制備 將同一批號的卡介苗(預先60℃1h滅活)置于高壓滅菌的石蠟油中，配成10mg/mL濃度，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 模型的制備 雄性wistar大鼠60只，體重180～230g，試驗前24h用8%硫化鈉將60只大鼠右后肢部皮膚脫毛，每只大鼠右后趾皮內(nèi)注射卡介苗佐劑0.1mL致炎，誘導關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生，致炎后第7天根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹情況，隨機分成5組，基質(zhì)對照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組、陽性對照組。

2.3.3 治療 于致炎后第7天，在上述大鼠右后肢脫毛區(qū)，分別貼敷骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏基質(zhì)、骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏小、中、大劑量及陽性對照藥藥物治療，面積約1cm×2cm2，連續(xù)7天。分別測量注射佐劑前正常右后足體積，并于注射佐劑后第7天、藥后3天、第5天、第7天測定同一足體積，取其兩次測定的平均值作為足體積，并每天記錄前后肢、耳、尾部病變的發(fā)生率與嚴重度，按照以下標準評分。0:無紅腫;1:小趾關(guān)節(jié)稍腫;2:趾關(guān)節(jié)和和足跖腫脹;3:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。根據(jù)評分標準計算各組動物的發(fā)病嚴重程度，并于第7天測定足體積后將所有大鼠處死，解剖，剝離胸腺、脾臟稱重，將所有大鼠的關(guān)節(jié)放入10%的甲醛中，常規(guī)染色，作組織學檢查，試驗結(jié)果見表4。從試驗可以看出:骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏連續(xù)給藥能夠?qū)姑庖咝躁P(guān)節(jié)炎腫脹程度，大鼠右后足體積(mL)明顯減小，與基質(zhì)組比較，中劑量組、大劑量組具有統(tǒng)計學意義，符合一定的量效關(guān)系。

表4 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對免疫性關(guān)節(jié)炎足體積的影響(±s，mL)

表4 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對免疫性關(guān)節(jié)炎足體積的影響(±s，mL)

注:與基質(zhì)對照組比較，*P ＜0.05。

組別 大鼠右后足體積(mL)正常 致炎后 藥后第3天 藥后第5天 藥后第7天基質(zhì)對照組 1.12 ±0.06 1.37 ±0.08 1.43 ±0.08 1.43 ±0.28 1.45 ±0.24小劑量組 1.10 ±0.09 1.35 ±0.05 1.36 ±0.05 1.36 ±0.09 1.37 ±0.14中劑量組 1.11 ±0.05 1.36 ±0.07 1.36 ±0.05* 1.24 ±0.05*1.25 ±0.13*大劑量組 1.12 ±0.09 1.36 ±0.05 1.35 ±0.04* 1.22 ±0.08*1.22 ±0.10*陽性對照組 1.11 ±0.08 1.38 ±0.06 1.36 ±0.06 1.23 ±0.03*1.32 ±0.10

表5 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏藥后炎癥分級及對胸腺、脾臟重量的影響(±s)

表5 骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏藥后炎癥分級及對胸腺、脾臟重量的影響(±s)

注:與基質(zhì)對照組比較，*P ＜0.05。

組別 藥后分級第3天 第5天 第7天內(nèi)臟重量脾重(g) 胸腺(g)基質(zhì)對照組 2.6 ±0.49 3.4 ±0.49 3.9 ±0.3 0.66 ±0.16 0.32 ±0.18小劑量組 2.3 ±0.46 2.9 ±0.54 3.2 ±0.6* 0.61 ±0.13 0.24 ±0.06中劑量組 2.1 ±0.54 2.8 ±0.5* 3.2 ±0.74*0.54 ±0.08 0.29 ±0.05大劑量組 1.9 ±0.70* 2.7 ±0.78* 3.0 ±1.1* 0.57 ±0.11 0.31 ±0.13陽性對照組 2.7 ±0.46 3.3 ±0.64 3.3 ±0.78 0.59 ±0.12 0.29 ±0.11

從試驗可以看出:骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏連續(xù)給藥期間，大鼠關(guān)節(jié)、尾部等腫脹進一步加重，但藥物組與基質(zhì)組比較，加重程度有所減輕，具有較明顯的量效關(guān)系;大鼠處死后，內(nèi)臟重量(脾重、胸腺重)與基質(zhì)組比較，變化不明顯。

病理檢查結(jié)果:模型組關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織充血、水腫，早期以中性白細胞為主，滑膜表層細胞有脫落，纖維素滲出，軟骨邊緣破壞，后期滑膜明顯增厚，肉芽組織、纖維組織增生明顯，有較多慢性炎細胞浸潤;藥物組肉芽組織、纖維組織明顯減輕，有較少慢性炎細胞浸潤，且隨劑量的增加，炎癥、滲出、增生明顯減輕。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”的范疇。中醫(yī)學從痹證角度認識本病，認為骨性關(guān)節(jié)炎是痹證中特殊證型。本病尚有肝腎不足，筋骨失養(yǎng)，瘀血阻絡(luò)之病機，認為關(guān)節(jié)局部損傷、炎癥或慢性勞損及中老年期發(fā)病原因不明的骨關(guān)節(jié)炎，以關(guān)節(jié)軟骨退化變性，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，滑膜肥厚為主要變化，以疼痛、關(guān)節(jié)運動受限的關(guān)節(jié)變形為主要臨床見癥，多與“虛”“邪”“瘀”密切相關(guān)。骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏溫腎填精、祛風除濕、化瘀消積、舒筋通絡(luò)，主治骨痹，證屬腎精不足、寒濕痹痛者，癥見頸項僵痛，或肩背沉緊疼痛，眩暈，活動不利，肢端麻木串痛，痿弱少力，勞累或遇冷加重，舌質(zhì)或偏暗，或舌胖質(zhì)淡，苔薄或薄膩，脈沉弱或沉緊。方中鹿角霜，味咸性溫，入足少陰腎經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)，溫腎助陽、填精補髓、強督脈、壯筋骨，故為君藥。葛根性涼，味甘、辛，入足太陽膀胱經(jīng)、足陽明胃經(jīng)，具有解肌止痙、升陽發(fā)散，舒筋脈、祛風濕、除痹痛等功效，為治項背強痛之要藥。威靈仙，性溫，味辛、咸，歸足太陽膀胱經(jīng)，辛散溫通，其性善走，既祛在表之風，又化在里之濕，通達經(jīng)絡(luò)，可導可宣，能祛風除濕，疏通血滯，消痰散積，通絡(luò)止痛，主治風濕痹痛，尤善治腰腳疼痛。以上兩味相伍，共入太陽，一柔一通，祛風除濕，通絡(luò)止痙，重在消除頸腰痹痛，協(xié)助鹿角霜標本兼治，共為臣藥。狗脊苦甘性溫，功能強腰膝，祛風濕，利關(guān)節(jié)，主治腎虛腰痛脊強，足膝軟弱無力，風濕痹痛，續(xù)斷補肝腎，強筋骨;川牛膝活血祛瘀，祛風利濕。以上三者皆入肝、腎經(jīng)，均有補肝腎、強筋骨之功。羌活、白芷、松節(jié)、虎杖均有祛風、除濕、止痛之功。全方相伍，共奏溫腎填精、祛風除濕、化瘀消積、舒筋通絡(luò)之效。

4 結(jié)論

骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏對醋酸扭體法、熱板法所致疼痛均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，能夠減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)，延長首次出現(xiàn)的扭體時間，即延長疼痛的潛伏期;提高熱板痛閾值。對免疫性關(guān)節(jié)炎有明顯的預防和治療作用，明顯減小免疫性關(guān)節(jié)炎的足體積，明顯降低關(guān)節(jié)炎的嚴重程度。骨痹鎮(zhèn)痛巴布膏可以增加頸椎血流量，中劑量與大劑量和基質(zhì)組比較具有明顯的差異性。

(2011-12-19收稿)