脂血和溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測的影響

張翠莉，劉 萍，魏文波

臨床標本不僅種類多樣，如血清、血漿、膿液、腦脊液、痰、分泌物等，并且同類型標本也可有不同的性質(zhì)，如血清標本會有不同程度的溶血、脂血標本等。筆者利用實時熒光定量PCR 方法檢測不同程度脂血、溶血標本中乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的結果，并進行統(tǒng)計學分析，以研究脂血、溶血是否影響熒光定量PCR 擴增HBV DNA 結果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光定量PCR 儀(型號:DA7600，中山大學達安基因股份有限公司);HBV DNA 試劑(達安基因有限公司，批號2010004);日立7180 全自動生化儀;紫外可見分光光度計;三酰甘油(triglyceride，TG)生化試劑(浙江伊利康生物技術有限公司，批號為20100105)。

1.2 標本采集

1.2.1 研究乳糜狀脂血因素實驗的標本收集 收集武警四川總隊醫(yī)院2010－04 至2010－05 血脂正常、無溶血的HBV DNA 血標本共30 例，每例采集血液3 ml。根據(jù)HBV DNA 濃度將所收集的30 例標本分為兩個水平:中高HBV DNA 濃度，即HBV DNA≥1.0 ×105標本15 例，設定為Ⅰ水平;HBV DNA 臨界濃度1.0 ×103至1.0 ×104標本15 例，設定為Ⅱ水平。收集乙肝表面抗體(HBsAb)陽性或兩對半全陰性、肝功能正常、無溶血的重度乳糜狀脂血標本及正常人血清標本各5 例，每例采集血液3 ml，及時分離血清，－20 ℃保存。

1.2.2 研究溶血因素實驗的標本收集 收集臨床乙肝患者無脂血、無黃疸血標本30 例，每人同時采集3 管，每管3 ml，其中兩管－20 ℃冷凍不同時間致不同程度溶血［1］，留做平行實驗。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計 設計不同血脂(三酰甘油)濃度和不同溶血程度的標本，并研究兩種因素對熒光定量PCR 測定兩個水平HBV DNA 結果是否有影響。

1.3.2 標本制作

1.3.2.1 兩種水平HBV DNA 不同TG 濃度標本的制作 (1)按照HBV DNA 濃度將臨床收集的標本分為兩個水平，分別為中高濃度HBV DNA≥1.0×10515 份(Ⅰ水平);臨界濃度，HBV DNA 介于1.0 ×103～1.0 ×10415 份(Ⅱ水平)。(2)按照美國國家膽固醇教育計劃的成人治療專家組Ⅲ(NCEPATP Ⅲ)血脂標準，結合本實驗，制作3 種TG 濃度梯度標本，極高TG 濃度脂血(TG≥5.64 mmol/L，A組)、高TG 濃度(TG 2.26 ～5.63 mmol/L，B 組)及正常血脂濃度標本(C 組)。(3)將所收集的重度乳糜狀的脂血標本混勻，進行TG 檢測，TG 為13.88 mmol/L;(4)HBV DNAⅠ水平不同濃度TG 標本的制作:AⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =1∶0∶1。BⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清:HBV DNAⅠ水平 =0.5∶0.5∶1。CⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =0∶1∶1。(5)HBV DNAⅡ水平不同濃度TG 標本的制作:AⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =1∶0∶1。BⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平=0.5∶0.5∶1。CⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =0∶1∶1。

1.3.2.2 兩種水平HBV DNA 不同溶血程度標本制作 采用－20 ℃冰箱冷凍不同時間，導致標本不同程度溶血，利用分光光度計氰化高鐵血紅蛋白測定法，檢測血紅蛋白濃度，從而將溶血標本分為重度溶血組(血紅蛋白＞5.0 g/L，D 組)、輕中度溶血組(0.8g/L ＜血紅蛋白＜5.0 g/L，E 組)［1］、無溶血組(F 組)。(1)HBV DNAⅠ水平3 種溶血標本，即:DⅠ組、EⅠ組、FⅠ組;(2)HBV DNAⅡ水平3 種溶血標本，即:DⅡ組、EⅡ組、FⅡ組。

1.3.3 HBV DNA 提取和檢測 參照達安基因公司試劑盒說明書進行，待測標本與室內(nèi)質(zhì)控標本同時進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，對三組標本PCR 結果取對數(shù)(Log10)進行數(shù)據(jù)轉換，其結果符合正態(tài)分布，對三組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，結果方差齊同。對三組數(shù)據(jù)進行F 檢驗。

2 結果

2.1 不同TG 濃度對HBV DNA 實時熒光定量PCR結果的影響 ABC 三組不同TG 濃度對HBV DNAⅠ、Ⅱ水平實時熒光定量PCR 擴增結果均無影響(P ＞0.05，表1)。

表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

分組例數(shù)(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡA156.26±0.913.12±0.71 B156.28±0.882.98±0.80 C156.57±0.983.09±0.69

2.2 不同溶血程度對HBV DNA 實時熒光定量PCR 結果的影響 在HBV DNAⅠ水平和Ⅱ水平中，不同程度的溶血對PCR 擴增結果均無影響(P ＞0.05，表2)。

表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

分組例數(shù)(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡD156.13±0.893.35±0.80 E156.21±0.913.48±0.75 F156.17±0.933.43±0.78

3 討論

PCR 技術由于其極高的檢測靈敏度和特異性，在臨床疾病診斷和療效觀察上得到了廣泛的應用，大大提高了疾病診斷的準確性和快速性。熒光定量PCR 所采用的UNG 防污染技術和熒光探針標記閉管檢測技術也有效控制了假陽性的發(fā)生。盡管如此，由于臨床標本的多樣性，比如溶血、脂血、藥物等因素的存在，可能造成熒光定量PCR 檢測結果假陰性發(fā)生。有研究表明，溶血標本因其血紅素及代謝產(chǎn)物的殘留抑制了DNA 聚合酶，會降低熒光定量PCR 結果，甚至出現(xiàn)假陰性［2，3］。黃其俊和吳堅敏［4］的研究表明，溶血程度不同對HBV DNA 定量結果的影響不同，即Hb ＞5.0 g/L 的重度溶血標本會導致HBV DNA 熒光定量PCR 檢測結果降低，而輕度溶血標本對HBV DNA 實時熒光定量結果的影響無顯著性差異。對于脂血是否影響熒光定量PCR 檢測結果的研究也存在矛盾之處。文獻［5，6］認為，脂血會降低HBV DNA 檢測結果，并且隨著TG 水平的增高，對HBV DNA 結果影響越大。李小寧等［7］研究表明，高TG 乳糜狀血清不會對HBV DNA≥1.0 ×105的檢測結果產(chǎn)生影響。

本研究結果表明，無論溶血程度如何，無論HBV DNA 濃度如何，溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測結果的影響都無顯著性差異，且高血脂不僅不會影響中高濃度HBV DNA 檢測結果，對臨界濃度HBV DNA 結果的影響差異亦無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。本研究還對HBV DNA 濃度＜1.0 ×103的標本進行了脂血和溶血因素的研究，檢測結果也100%符合，表明脂血和溶血不會導致假陽性結果產(chǎn)生。

本實驗在提取核酸過程中，血紅蛋白能被有效地去除，故得出了血紅蛋白對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 沒有差異性影響的結果，不同的血脂濃度對檢測結果的影響差異也無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。對于與黃其俊等［4］研究結果的矛盾，可能是由于實驗設計和統(tǒng)計學處理的不同所導致。本研究設計的各溶血組(D、E 組)與對照組(F)均采用同一患者同時采集的樣本進行，使得整個實驗更具有可比性，結果更具有說服力。在脂血是否影響實時熒光定量PCR 檢測HBV DNA 研究上，本研究結果與高峰等［5］的研究結果有差異，分析其原因可能是:(1)試劑靈敏度和特異性的差異;(2)統(tǒng)計學分析時所采用的標準及方法不同所造成。實驗本研究結果在同李小寧等［7］研究結果一致的同時，本研究還從HBV DNA 臨界值水平進行了脂血對熒光定量PCR 方法是否具有影響的研究。從本研究所得出的結論可以看出，高血脂乳糜狀標本不會影響熒光定量PCR 方法檢測HBV DNA。

［1］ 董振南，高 靜. 不同程度溶血對常規(guī)生化檢驗結果影響的探討［J］. 軍醫(yī)進修學院學報，2005，26 (5):329－331.

［2］ Akane A，Matsubara K，Nakamura H，et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid(DNA)from Bloodstains，a major inhibitor of polymerase chain reaction(PCR)amplification［J］. J Forensic Sci，1994，39(2):362－372.

［3］ 陳英劍，胡成進，齊發(fā)蓮，等. 溶血對熒光定量PCR檢測HBV DNA 結果的影響［J］. 國外醫(yī)學臨床生化與檢驗學分冊，2004，25(6):563－564.

［4］ 黃其俊，吳堅敏. 不同程度溶血對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 結果的影響［J］. 實驗與檢驗醫(yī)學，2008，26 (2):211－213.

［5］ 高 峰，高慧華，楊學文. 脂血因素對熒光定量PCR檢測乙肝病毒DNA 的影響及解決措施［J］. 臨床檢驗雜志，2007，25(5):359－360.

［6］ 朱艷華，張慧敏. 脂血對檢測HBV DNA 的影響及解決辦法［J］. 內(nèi)蒙古醫(yī)學雜志，2009，10:1214－1215.

［7］ 李小寧，黃升海. 脂血標本對HBV DNA 定量檢測結果的影響［J］. 皖南醫(yī)學院學報，2007，26(4):285－286.