胎盤型鈣黏蛋白在尋常性銀屑病患者血清和皮損中的表達(dá)及意義

李高峰，袁皓琛

銀屑病皮損組織病理學(xué)上表現(xiàn)為角化不全和角化過度，角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）高度增生。KC間主要連接形式為橋粒和半橋粒連接，這種連接方式是由相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生卵圓形致密增厚而共同構(gòu)成，而胞膜間隙之間重要的黏附分子胎盤型鈣黏蛋白（P-cad）是表皮連接結(jié)構(gòu)中重要的黏附蛋白。P-cad介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，并通過一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的變化，參與細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)過程，可引起細(xì)胞過度增生[1]。本研究分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫組化法檢測(cè)血清和皮損中P-cad的表達(dá)，探討P-cad在尋常性銀屑病發(fā)病中的作用及其與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 選擇2010年1～12月在揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院和蘇北人民醫(yī)院皮膚科確診為尋常性銀屑病患者40例，其中進(jìn)行期16例，穩(wěn)定期15例，消退期9例；男22，女18，平均年齡（35.78±15.62）歲（17～62歲）；健康對(duì)照40名，健康對(duì)照血清來自兩所醫(yī)院皮膚科醫(yī)師、學(xué)生和實(shí)習(xí)生以及正常體檢者，其中男26名，女14名，平均年齡（33.26±11.35）歲（20～53歲）。對(duì)照組正常皮膚來自兩所醫(yī)院整形美容患者切除下的正常皮膚。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有紅斑狼瘡、天皰瘡、皮肌炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，以及其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病，且在3個(gè)月內(nèi)曾使用過大劑量免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物。對(duì)照組排除以上標(biāo)準(zhǔn)外尚需排除銀屑病。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過，研究對(duì)象均簽署知情同意書。患者組和健康對(duì)照組在年齡、性別等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)患者的銀屑病皮損嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）進(jìn)行評(píng)分。

1.1.2 主要試劑 人P-cad雙抗體夾心ELISA試劑盒、兔抗人P-cad（胎盤型鈣黏蛋白）、即用型SABC檢測(cè)試劑盒（羊抗兔）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 抽取患者及對(duì)照者外周靜脈血3 ml處理并保存。皮損取材：銀屑病患者選擇具有代表性的典型的原發(fā)皮損取材（患者組與對(duì)照組均取自上肢）。

1.2.2 皮損中P-cad檢測(cè) 皮損中P-cad檢測(cè)按所購(gòu)試劑盒說明進(jìn)行，①輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，并常規(guī)脫蠟至水。②30%H2O21份+蒸餾水10份混合滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。③熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mmol/L 枸櫞酸鹽緩沖液，加熱至沸騰，冷卻后PBS緩沖液洗滌1～2 次。④滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。⑤滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4 ℃過夜，PBS緩沖液洗2 min，共3次。⑥滴加生物素化兔抗IgG，20～37 ℃ 20 min。PBS緩沖液（pH7.2～7.6）洗2 min，共3次。⑦滴加試劑SABC，20～37 ℃ 20 min。PBS洗5 min，共4次。⑧DAB顯色。⑨ 蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽性染色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞間連接處，并出現(xiàn)黃色或棕黃色的細(xì)小顆粒著色為陽性細(xì)胞。光鏡下于KC陽性染色處隨機(jī)選擇5個(gè)視野，采用雙評(píng)分方法：①根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分率評(píng)分：≤25%為 0分，26%～ 50%為 1分，51%～ 75%為 2分，＞75%為3分。將上述兩項(xiàng)所得積分相加，1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～ 6分判為“+++”，“++”和“+++”視為陽性表達(dá)。

1.2.4 血清中P-cad檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，分析數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；血清中P-cad表達(dá)組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；正常皮膚與尋常性銀屑病皮損P-cad表達(dá)陽性率的差異采用χ2檢驗(yàn)，皮損表達(dá)強(qiáng)度與PASI評(píng)分的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性，P＜0.01認(rèn)為差異有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 尋常性銀屑病患者血清中P-cad的表達(dá)

P-cad在40例患者和40名對(duì)照者血清中均有表達(dá)，尋常性銀屑病組表達(dá)為（14.27±7.85）μg/L ，而正常對(duì)照組為（4.78±3.31）μg/L，P-cad在尋常性銀屑病組血清中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 尋常性銀屑病患者血清中P-cad表達(dá)水平與PASI評(píng)分的相關(guān)性

40例尋常性銀屑病患者血清P-cad的表達(dá)水平與PASI評(píng)分（Pearson相關(guān)系數(shù)值）r=0.820，P ＜0.01，兩者呈正向線性相關(guān)（圖1）。

2.3 P-cad在尋常性銀屑病患者皮損中的表達(dá)

2.3.1 表達(dá)定位 健康對(duì)照組P-cad表達(dá)定位在表皮基底層細(xì)胞膜或細(xì)胞間連接處，棘層可見極少量表達(dá)，均呈棕黃色顆粒狀，呈不連續(xù)表達(dá)；患者組P-cad表達(dá)除在基底層有棕黃色顆粒沉積外，棘層、顆粒層均有表達(dá)，各層表達(dá)數(shù)量、強(qiáng)弱不等（圖2，3）。2.3.2 表達(dá)百分率 對(duì)照組和患者組表皮基底層P-cad表達(dá)陽性率均為100%，棘層及以上陽性率分別為4.64%和80.92%，患者組顯著高于對(duì)照組（χ2=30.34，P ＜ 0.01）（表 1）。

圖2 P-cad在正常對(duì)照者皮膚中的表達(dá)

圖3 P-cad在尋常性銀屑病患者皮損中的表達(dá)

表1 P-cad在銀屑病患者和正常對(duì)照者皮損中的表達(dá) （例）

2.4 尋常性銀屑病患者皮損中P-cad表達(dá)與PASI評(píng)分的相關(guān)性

12 例尋常性銀屑病患者PASI 評(píng)分的值越高，其皮損P-cad表達(dá)強(qiáng)度越高。采用 Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析顯示，12例尋常性銀屑病患者皮損中P-cad表達(dá)強(qiáng)度與 PASI評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.615，P＜0.05）（圖 4）。

3 討論

鈣黏蛋白是細(xì)胞間連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白，是一類鈣離子依賴型跨膜黏附分子。至今已發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的鈣黏蛋白超家族已超過80種，包括經(jīng)典鈣黏蛋白，橋粒鈣黏蛋白等。經(jīng)典鈣黏蛋白含有723～748個(gè)氨基酸，主要分為P-cad、E-cad和N-cad三大類[2]。

P-cad位于細(xì)胞邊緣，特別是細(xì)胞-細(xì)胞連接區(qū)域，通過附著蛋白與胞內(nèi)蛋白結(jié)合，相鄰細(xì)胞中蛋白絲束通過P-cad和附著蛋白編織成了一個(gè)廣泛的網(wǎng)絡(luò)，將相鄰細(xì)胞連接在一起。王永賢等[3]和楊井等[4]研究發(fā)現(xiàn)，P-cad在正常人主要表達(dá)于基底層，表達(dá)微弱且不連續(xù)，其他層中未見表達(dá)；而銀屑病皮損中P-cad在表皮全層均有強(qiáng)表達(dá)，且兩者表達(dá)的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與筆者的研究結(jié)果基本一致。Tinkle 等[5]和Eunkyung等[6]研究發(fā)現(xiàn)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)靶向去除小鼠表皮E-cad，結(jié)果P-cad在基底層反應(yīng)性表達(dá)增加，推測(cè)銀屑病皮損處E-cad受損，P-cad表達(dá)上調(diào)是對(duì)E-cad受損起到部分代償作用，而正是這種部分代償導(dǎo)致上皮分化和增生的改變。另有研究表明，E-cad表達(dá)未發(fā)生變化，P-cad在銀屑病皮損中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，表達(dá)模式從正常的基底層變?yōu)楸砥と珜覽7]，認(rèn)為銀屑病皮損中P-cad的這種表達(dá)模式和強(qiáng)度的改變可能與銀屑病表皮KC的延遲分化和過度增殖有關(guān)。

本研究對(duì)皮損中P-cad的檢測(cè)結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者皮損處P-cad在表皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，推測(cè)P-cad可能與KC細(xì)胞的增殖有著重要的聯(lián)系。皮損部位P-cad表達(dá)增加，通過細(xì)胞間的連接體系及細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，造成細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，引起基底層和棘層這兩類表皮增生及細(xì)胞增殖周期的改變，最終導(dǎo)致KC細(xì)胞的增殖過度。本研究結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者血清中P-cad表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，且血清中P-cad的表達(dá)水平與患者的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，表明P-cad可能參與了尋常性銀屑病的發(fā)生。推測(cè)患者血清中P-cad表達(dá)水平的升高可能與銀屑病患者表皮過度增生，表皮細(xì)胞凋亡速度加快，引起蛋白質(zhì)的分解增加，造成P-cad大量釋放入血液而升高有關(guān)；也可能被某些酶分解或者其他機(jī)制破壞后進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清中P-cad水平升高。

P-cad是表皮細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)中的重要黏附分子，對(duì)表皮形態(tài)和功能的維持起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)其在尋常性銀屑病患者血清和皮損中的表達(dá)出現(xiàn)異常，說明其與尋常性銀屑病的發(fā)病存在著聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不清楚，還有待今后進(jìn)一步的深入研究。

[1]Angst B, Marcozzi C, Magee A. The cadherin superfamily:diversity in form and function [J]. J Cell Sci, 2001, 114 (4):629-641.

[2]Albelda SM. Role of integrins and other cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis [J]. Lab Invest, 1993,68(1):4-9.

[3]王永賢, 李政霄, 彭振輝. E-鈣黏素、P-鈣黏素在進(jìn)行期銀屑病皮損中的檢測(cè) [J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2007,21(1):24-25,40.

[4]楊井, 涂亞庭. E-鈣黏素、P-鈣黏素在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)及其意義 [J]. 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志, 2005, 21(5):343-345.

[5]Tinkle CL, LechlerT, Pasolli HA, et al. Conditional targeting of E-cadherin in skin:insights into hypeproliferative and degenerative responses [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(2):552-557.

[6]Eunkyung C, Pau WC, Charles AP, et al. Amphiregulin causes function down regulation of adherens junctions in psoriasis [J]. J Invest Dermatol, 2005, 124(6):1134-1140.

[7]Zhou S, Matsuyoshi N, Takeuchi T, et al. Reciprocal altered expression of T-cadherin and P-cadherin in psoriasis vulgaris [J].Br J Dermatol, 2003, 149(2):168-173.