超聲輔助萃取-高效液相色譜熒光檢測法測定貽貝中的多環(huán)芳烴

陳雪昌，孫秀梅，胡紅美，陳 朋，郭遠(yuǎn)明，梅光明

（浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316100）

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是一種持久的環(huán)境和食品有毒污染物，廣泛分布于土壤、水體、空氣、食品以及一些日常用品中。其在環(huán)境中雖含量不高，由于難以通過生物降解消除，會經(jīng)過過食物鏈逐步富集濃縮會逐漸達(dá)到相當(dāng)高的含量。因此，尋找一種簡單、快速、高靈敏的多環(huán)芳烴的分離分析技術(shù)具有重要的意義。

目前，多環(huán)芳烴主要采用高效液相色譜法（HPLC）[1-2]、高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLC-MS）[3]，氣相色譜法（GC）[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[6]、毛細(xì)管電泳分析法（CE）[7]、薄層掃描法[8]、超臨界流體色譜法（SFC）[9]以及熒光光度法[10]，分析檢測。分析對象多為大氣，水體，沉積物，魚、蝦等水產(chǎn)品。

貽貝作為人類的食物，又是海洋食物鏈的一環(huán)，有國際貽貝監(jiān)測報告[11]認(rèn)為，用貽貝作為近海污染指示物，比選擇像海藻、魚類或海水更具有代表性和價值。本文以貽貝為研究對象，建立了超聲輔助萃取-高效液相色譜熒光檢測法測定貽貝中的多環(huán)芳烴的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

紫貽貝Mytilus edulis：新鮮，購自舟山市普陀?xùn)|河市場。

1.2 主要試劑

環(huán)己烷、二氯甲烷（農(nóng)殘級，美國J T Baker公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；氫氧化鉀（優(yōu)級純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；無水硫酸鈉（分析純，上海化學(xué)試劑總廠），使用前650℃烘干4 h；硫酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取一定量的熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘，苯并[g,h,i]芘和茚并[1,2,3-cd]芘標(biāo)準(zhǔn)品（中國計量科學(xué)研究院），用丙酮定容至10 mL，配置成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4℃避光保存，使用時用流動相逐級稀釋至所需濃度。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Waters Alliance高效液相色譜儀（美國Waters公司），配2695熒光檢測器；高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；渦旋混合器（德國Ika公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；Florisil固相萃取柱（250 mg，3 mL，德國CNW Technologies GmbH公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品制備

將紫貽貝用海水洗凈泥沙，濾干水分。用小刀剝開外殼，取出整個貽貝。稱取約250 g置于高速組織搗碎機(jī)中制成勻漿。

1.4.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱取5.00 g試樣，置于50 mL聚四氟乙烯管中，加入25 mL甲醇和10 mL 50%的氫氧化鉀溶液，超聲萃取1 h（30℃）后，6 000 r/min離心5 min，提取上清液于另一50 mL聚四氟乙烯管中，加入10 mL環(huán)己烷，超聲10 min（30℃），2 000 r/min渦旋2 min，6 000 r/min離心5 min，吸取上層環(huán)己烷于125 mL分液漏斗中，下層液體再用10 mL環(huán)己烷重復(fù)萃取2次，合并環(huán)己烷層。

環(huán)己烷萃取液依次用10 mL 50%甲醇/水溶液、5 mL水、5 mL水和1 mL 60%硫酸溶液重復(fù)振搖，靜置分層，棄去下層液體，并用30 g/L硫酸鈉水溶液洗環(huán)己烷層至中性，以達(dá)到清洗萃取液目的，將環(huán)己烷層經(jīng)無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移至100 mL梨形瓶中，在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（35 r/min，152 mbar），濃縮至1～2 mL即可。

1.4.3 樣品凈化

依次用3 mL二氯甲烷、5 mL環(huán)己烷活化Florisil固相萃取柱。將濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移至柱子中，并依次用1 mL、2 mL環(huán)己烷清洗梨形瓶，全部轉(zhuǎn)移至柱子中；用9 mL環(huán)己烷-二氯甲烷溶液（3:1，v/v）洗脫，收集于100 mL梨形瓶中，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（35 r/min，152 mbar）至干。準(zhǔn)確加入2 mL乙腈，充分溶解后，用0.22 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測定。

1.4.4 色譜工作條件

色譜柱：Supelcosiltm LC-PAH 柱（250 mm×4.6 mm×5.0 μm）；流動相：乙腈-水（65:35，v/v）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；以保留時間定性，外標(biāo)法-峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的選擇

多環(huán)芳烴常用的檢測器有紫外、熒光、化學(xué)發(fā)光等方法，通常紫外檢測法靈敏度較低，而化學(xué)發(fā)光檢測法雖然無需光源、背景噪音低，檢測靈敏度高，但需要引入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本研究選擇操作簡單，靈敏度高的熒光檢測法。根據(jù)各化合物保留時間、最大吸收波長設(shè)定相應(yīng)的熒光條件。苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽性質(zhì)相近，選擇同一熒光條件。各多環(huán)芳烴的熒光檢測程序見表1。

表1 6種多環(huán)芳烴的熒光檢測程序Tab.1 Fluorescence detection program for six PAHs

2.2 色譜分離條件

為了獲得滿意的分離度，對流動相、柱溫、流速等因素進(jìn)行了考察，得到的優(yōu)化結(jié)果見1.4.4。優(yōu)化條件下，6種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1。結(jié)果表明，該條件下，6種多環(huán)芳烴實現(xiàn)了很好的分離。

圖1 6種多環(huán)芳烴（10 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 6 kinds of PAHs standard

2.3 萃取方式的選擇

本試驗選擇超聲波輔助萃取法，操作簡單，萃取效率高。首先，試樣中加入皂化劑超聲處理，有效的除去脂類物質(zhì)的干擾。接著加入環(huán)己烷對皂化后的上清液超聲萃取，使親脂性的多環(huán)芳烴轉(zhuǎn)移進(jìn)入環(huán)己烷層。

2.4 提取液凈化

試樣經(jīng)造化萃取后，還殘留痕量的脂肪族化合物和一些極性較強(qiáng)的組分，需要進(jìn)一步凈化。采用甲醇-水體系能有效去除正己烷層中脂肪組織水解的脂蛋白。60%硫酸溶液可以有效地凈化生物樣品中脂肪和其他雜質(zhì)。

比較了C18和Florisil柱的凈化效果，確定選擇對分離脂肪族和芳香族化合物效果較好的Florisil柱為固相萃取柱。

2.5 工作曲線和檢出限

用流動相稀釋多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到0.002～0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照色譜工作條件進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，6種多環(huán)芳烴在0.002～0.5 mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，工作曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 方法線性回歸方程和檢出限Tab.2 The linear regression equations and determination limits of the proposed method

2.6 回收率和精密度試驗

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對待測試樣進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗，以考察方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。對市售的紫貽貝，進(jìn)行樣品制備后，分別加入高（500 μg/kg）、中（100 μg/kg）、低（10.0 μg/kg）3 種濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次，實驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3個加標(biāo)濃度下，回收率為78%～92%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～6.3%，滿足分析檢測要求。

表3 方法的回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Result of test of recovery and precision of the proposed method(n=6)

3 結(jié)論

本工作建立了超聲波輔助萃取-高效液相色譜熒光檢測法測定紫貽貝中6種多環(huán)芳烴的方法。方法靈敏，超聲萃取簡單，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，實驗結(jié)果令人滿意，可以適用于貽貝中多環(huán)芳烴的檢測，并有望應(yīng)用于其他水產(chǎn)品中多環(huán)芳烴的檢測。

[1]饒 竹,李 松，何 淼，等.高效液相色譜-熒光-紫外串聯(lián)測定土壤中16種多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué)，2007,35:954-958.

[2]李先國,閻國芳,周 曉,等.固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法測定海水中的多環(huán)芳烴[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2009,30(5):1 087-1 092.

[3]趙恒強(qiáng),陳軍輝,程紅艷,等.高效液相色譜-電噴霧銀離子誘導(dǎo)電離飛行時間質(zhì)譜定性分析高沸點多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué),2010,38:1 599-1 603.

[4]徐 媛,劉文民,趙景紅,等.固相萃取攪拌棒萃取-氣相色譜分析海水中的多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué)，2005,33:1 401-1 404.

[5]張廉奉，李秀娟，劉翠霞,等.三甲基杯[6]芳烴固相微萃取-氣相色譜法測定土壤中的多氯聯(lián)苯[J].分析化學(xué),2007,35:1 269-1 273.

[6]李曉敏,張慶華,王 璞,等.攪拌子固相吸附-熱脫附-氣相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜法快速測定空氣中多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué),2011,39:1 641-1 646.

[7]宋冠群,林金明.多環(huán)芳烴的濁點萃取毛細(xì)管電泳分析[C]//第二屆全國環(huán)境化學(xué)學(xué)術(shù)報告會論文集.2004.

[8]厲曙光.薄層掃描法測定食物油及其加熱產(chǎn)物中多環(huán)芳烴的研究[D].南京:南京鐵道學(xué)院,1989.

[9]孫云鵬.多環(huán)芳烴的超臨界流體色譜分離研究[J].色譜,1995,13(5):398-399.

[10]於立軍,李耀群,睦 蔚.多環(huán)芳烴的Shpol’skii低溫?zé)晒夤庾V分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2002,22(5):819-821.

[11]The international mussel watch report of a workshop sponsored by the environmental studies board commission on natural resources national research council[C].Washington D C:National Academy of Science,1980.