航天誘變復(fù)合菌劑發(fā)酵生產(chǎn)馬鈴薯渣菌體蛋白飼料研究

張宗舟 ，張 揚(yáng) ，趙 慧

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001；2.天水師范學(xué)院物理與信息科學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001；3.天水師范學(xué)院工學(xué)院，甘肅 天水 741001）

馬鈴薯是最有發(fā)展前景的高產(chǎn)經(jīng)濟(jì)作物之一，馬鈴薯的種薯及各種加工產(chǎn)品已成為全球經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中的重要組成部分[1-2]。2009年我國(guó)的馬鈴薯年產(chǎn)量已突破8 000萬(wàn)t，除50%用于鮮食、留種和飼用外，其余多用于馬鈴薯淀粉的加工[3]。馬鈴薯淀粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶動(dòng)了馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，同時(shí)也產(chǎn)生了大量的鮮薯渣。薯渣中自帶菌多，不易儲(chǔ)存、運(yùn)輸，且易腐爛變質(zhì)產(chǎn)生惡臭，造成環(huán)境污染。倘若烘干則成本過(guò)高，增加企業(yè)負(fù)擔(dān)，因此通常直接作為飼料或當(dāng)成廢渣作掩埋處理。隨著人們對(duì)環(huán)保問(wèn)題的日益重視，薯渣的開發(fā)利用已成為研究的焦點(diǎn)[4-7]，對(duì)薯渣進(jìn)行綜合開發(fā)利用，不僅能減少環(huán)境污染，解除馬鈴薯淀粉加工業(yè)的后顧之憂，而且具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

馬鈴薯渣主要含有水、細(xì)胞碎片、殘余淀粉顆粒和薯皮細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)合物。鮮薯渣中含水量高達(dá)90%左右，其水分被嵌入在殘余完整細(xì)胞中，需要通過(guò)細(xì)胞膜交換到外界除去，表現(xiàn)出典型膠體的理化特性，不具備液態(tài)流體性質(zhì)。其化學(xué)成分包括淀粉、纖維素、半纖維素、果膠、游離氨基酸、寡肽、多肽和灰分，其中殘余淀粉含量高達(dá)35%（以干基計(jì)），纖維素、果膠含量也較高，分別達(dá)到21%和17%（以干基計(jì)）。筆者以馬鈴薯渣為原料，利用航天誘變獲得的黑曲霉突變株ZM-8、啤酒酵母突變株YB-6、白地霉、熱帶假絲酵母進(jìn)行固體共發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白，以期將馬鈴薯渣轉(zhuǎn)化為高蛋白飼料，提高馬鈴薯渣的蛋白質(zhì)含量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開辟飼料新資源，避免薯渣對(duì)環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)菌株為黑曲霉突變株ZM-8（Asp.niger ZM-8）、釀酒酵母 YB-6（Sac.cerevisiae YB-6）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、白地霉（Geotrichum candidum）。其中黑曲霉ZM-8是將黑曲霉搭載于返回式航天器上，經(jīng)空間特殊的環(huán)境條件誘變發(fā)生變異后，通過(guò)微生物學(xué)特性研究和變種的分離、培養(yǎng)，最終選育出的菌株，其糖化酶活力最高達(dá)到 21 000 U/g，纖維素酶活力達(dá)到5 600 U/g以上。由于有較高的纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶活力，該菌株保存在中國(guó)CCTCC，保存號(hào)CCTCC-NO：M209125。釀酒酵母YB-6同樣是航天誘變選育獲得。

1.1.2 供試原料 馬鈴薯渣由秦安縣淀粉廠提供，65℃烘干，粉碎過(guò)40目篩備用。麩皮為市售。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）麥麩培養(yǎng)基：將麩皮和水按1∶1混合均勻后，裝入250 mL的三角瓶，每瓶裝50 g；（2）麥芽汁液體培養(yǎng)基：將麥芽汁濾液稀釋到5波美度，pH值約6.4；（3）麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：將麥芽汁液體培養(yǎng)基加入2%瓊脂即成；（4）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：干馬鈴薯渣70 g，麩皮30 g，加自來(lái)水110 mL混合、拌勻后，再加1%KH2PO4以及不同配比的白糖、硫銨、尿素、三十烷醇。上述培養(yǎng)基均需在1.0×105Pa、121℃滅菌 30 min，pH 值自然。

1.1.4 儀 器 電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、手提壓力蒸氣滅菌鍋、CS213電熱恒溫培養(yǎng)箱（重慶試驗(yàn)設(shè)備廠）、THZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) （1）黑曲霉突變株ZM-8：將黑曲霉ZM-8母種接到PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，再接種到250 mL三角瓶麩皮培養(yǎng)基上，28℃擴(kuò)大培養(yǎng)72 h。（2）釀酒酵母YB-6：將釀酒酵母YB-6母種接種到麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，再接種到250 mL麥芽汁液體搖瓶培養(yǎng)基中，28℃、124 r/min 擴(kuò)大培養(yǎng) 72 h。（3）白地霉：將白地霉母種接到PDA斜面培養(yǎng)基上，8℃培養(yǎng)72 h，再接種到250 mL三角瓶麩皮培養(yǎng)基，28℃擴(kuò)大培養(yǎng)72 h。（4）熱帶假絲酵母：同白地霉的擴(kuò)大培養(yǎng)方式。

1.2.2 發(fā)酵工藝 （1）原料配制：干馬鈴薯渣140 g、麥麩 60 g、水 220 mL，拌勻，潤(rùn)水。（2）蒸煮：將原料放置蒸煮鍋中蒸30 min后出鍋，并加入不同比例的尿素、白糖、磷酸二氫鉀和三十烷醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。（3）復(fù)合菌劑的制備與接種：將用三角瓶麩皮固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)得到的航天誘變菌種黑曲霉ZM-8和白地霉，以及用麥芽汁液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)得到的熱帶假絲酵母、啤酒酵母YB-6按不同比例混合制成太空復(fù)合菌劑。再將制成的太空復(fù)合菌劑于30℃接種到蒸煮好的原料中，拌勻。（4）堆制與培養(yǎng)：接種航天誘變復(fù)合菌劑之后，堆制24 h（堆溫≤36℃），期間不斷攪拌，24 h后原料上長(zhǎng)滿菌絲體，顏色為灰白色。將原料上發(fā)酵盤，培養(yǎng)（溫度≤36℃），48 h后培養(yǎng)結(jié)束。（5）出料與烘干：將培養(yǎng)好的半成品從發(fā)酵盤中移出，于烘干室進(jìn)行烘干。烘干溫度為100℃，時(shí)間控制在3 h以內(nèi)，水分控制在5%～7%為宜。（6）粉碎與質(zhì)檢：烘干后降溫，粉碎，進(jìn)行質(zhì)檢。粗蛋白的測(cè)定采用GB/T 6434-94凱氏定氮法。馬鈴薯渣發(fā)酵工藝如圖1所示。

圖1 發(fā)酵工藝流程

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化 （1）多菌復(fù)配適宜配比的確定：以培養(yǎng)基中黑曲霉 ZM-8（A）、釀酒酵母（B）、熱帶假絲酵母（C）、白地霉（D）為考察因素，選用四因素三水平L9（34）正交表（表1），設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，自然pH值發(fā)酵，低溫烘干后分析粗蛋白含量。

表1 正交試驗(yàn)因素水平 （g）

（2）培養(yǎng)基配方中各營(yíng)養(yǎng)元素含量的確定:以培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分白糖（A）、硫銨（B）、尿素（C）、三十烷醇（D）為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，選用L9（34）正交表（表2），自然pH值發(fā)酵，低溫烘干后分析粗蛋白含量。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS軟件對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行四因素三水平方差分析和正交試驗(yàn)極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌復(fù)配不同配比對(duì)產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

由表3極差分析可知，各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量影響的主次順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即釀酒酵母對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響最大，其次是熱帶假絲酵母、白地霉菌，最后是黑曲霉突變株ZM-8；各水平的最優(yōu)水平組合為A3B1C2D3，即釀酒酵母1.5 g、熱帶假絲酵母2.0 g、白地霉菌2.5 g、黑曲霉突變株ZM-8 2.0 g，在此條件下固體發(fā)酵馬鈴薯渣，產(chǎn)物中粗蛋白含量可達(dá)32.1%。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

由表4極差分析可知，各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響的主次順序是B＞D＞C＞A，即硫胺對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響最大，其次是三十烷醇、尿素，最后是白糖；各水平的最優(yōu)水平組合為A1B2C2D1，即白糖 4 g、硫銨 7 g、尿素 4 g、三十烷醇2.5 mg/L，在此優(yōu)化條件下發(fā)酵馬鈴薯渣，產(chǎn)物中粗蛋白含量可達(dá)32.5%。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小 結(jié)

（1）利用航天誘變獲得的優(yōu)良菌種——黑曲霉ZM—8和啤酒酵母YB-6、熱帶假絲酵母和白地霉復(fù)配制成的復(fù)合菌劑，在馬鈴薯渣的培養(yǎng)基上共發(fā)酵，可以獲得蛋白質(zhì)含量較高的菌體蛋白飼料（粗蛋白含量為32.1%），粗蛋白含量提高了5.84倍（原料中粗蛋白5.5%）。航天復(fù)合菌劑的最優(yōu)配比為：釀酒酵母YB-6 1.5 g、熱帶假絲酵母2.0 g、白地霉菌2.5 g，黑曲霉突變株ZM-8 2.0 g。這說(shuō)明了利用復(fù)合菌合成菌體蛋白的效果比單一菌種要好，且利用航天誘變來(lái)獲得優(yōu)良的微生物變異種，并將其用于飼料菌體蛋白培養(yǎng)的方法行之有效。

（2）利用航天誘變選育出的混合菌種發(fā)酵馬鈴薯渣，通過(guò)正交試驗(yàn)獲得了適宜的培養(yǎng)基配方，即白糖4 g、硫銨7 g、尿素4 g、三十烷醇2.5 mg/L。該配方可使產(chǎn)物中粗蛋白的含量達(dá)32.5%，試驗(yàn)結(jié)果較好。

（3）馬鈴薯渣經(jīng)航天誘變混合菌種共發(fā)酵獲得的菌體蛋白飼料，纖維素含量降低，粗蛋白含量顯著提高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值增加。該方法在生產(chǎn)中推廣，可以提高馬鈴薯渣的利用價(jià)值，充分利用資源，減輕環(huán)境污染，能帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、生態(tài)效益。

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