產(chǎn)異淀粉酶嗜熱菌選育及產(chǎn)酶條件的研究

胡先望 ，陳 朋 ，梁 寧 ，王 雄 ，嚴(yán)曉娟

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

異淀粉酶在生化分類上屬于淀粉水解酶類（EC3.2.1.68）。它可以從寡聚糖的非還原末端水解切開α－1，6糖苷鍵，釋放出葡萄糖，可廣泛應(yīng)用于淀粉糖漿、啤酒和酒精等的生產(chǎn)。近年來，以淀粉為原料利用酶技術(shù)開發(fā)出的低聚異麥芽糖因其安全無毒、理化性質(zhì)獨特等優(yōu)良性質(zhì)而備受關(guān)注[1-2]。異淀粉酶在高濃度的葡萄糖環(huán)境中也能將游離葡萄糖殘基通過酶催化逆反應(yīng)將葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到另一底物形成α－1，6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的低聚糖[3]。以淀粉為原料，經(jīng)過α-淀粉酶、β-淀粉酶和異淀粉酶（或α-葡萄糖苷酶）的協(xié)同作用，可生產(chǎn)低聚異麥芽糖或糖醇，其轉(zhuǎn)化率一般為55%～60%[4]。我國工業(yè)用異淀粉酶主要來自進口，近年來國內(nèi)朱學(xué)軍[5]、王弋博[6]、夏靜[7]、郭宏文等[8-9]分別進行了產(chǎn)異淀粉酶菌種的選育工作，其他關(guān)于嗜熱異淀粉酶的研究報道則較少。筆者以嗜熱脂肪芽孢桿菌為原始菌種，進行誘變及優(yōu)勢菌株選育，并對篩選出的突變菌株的產(chǎn)酶性質(zhì)做了初步探討，旨在獲得耐高溫、活性較高、穩(wěn)定性較好的產(chǎn)酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus，菌種編號 1.1865），購于中國科學(xué)院微生物研究所，經(jīng)誘變處理得到高產(chǎn)異淀粉酶的突變菌株UM761。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：TU-1800PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、GL-21M離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、MF99-3自動核酸蛋白分離層析檢測儀（上海滬西分析儀器廠）、LDZM-75型立式智能壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、5 L全自動發(fā)酵罐（日本B.E.Marubsishi）等。試劑：瓊脂、蛋白胨、牛肉浸膏（北京雙旋微生物培養(yǎng)基廠）、氯化鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉、冰乙酸、鹽酸、氫氧化鈉（上海試劑三廠）、可溶性淀粉（北京化工試劑廠）、硫酸銨（西安試劑廠）、3，5—二硝基水楊酸（DNS）、硝基胍、牛血清白蛋白（中科院上海生化研究所）、酵母粉（蘭州金寶瑞膠囊有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將嗜熱脂肪芽孢桿初始菌接種于LB營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，45℃培養(yǎng)24 h，取菌液1 mL測定菌密度A600。當(dāng)A600≥2.0后，培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min。收集上清液，測定異淀粉酶活力。

1.2.2 菌種誘變 取培養(yǎng)至對數(shù)期菌液10 mL（OD600=0.569），3 000 r/min離心 15 min，棄上清，用無菌生理鹽水制成菌懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)（108個/mL）。取5 mL加入到含有0.5 mg/mL的亞硝基胍溶液的培養(yǎng)皿中，并將處理皿放在無菌磁力攪拌器，15 W、254 nm紫外燈30 cm處照射。用紫外燈照射復(fù)合處理，分別于30、40、50 min取出0.5 mL的培養(yǎng)液，加入0.5 mL 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，然后稀釋涂平板，取未經(jīng)NTG處理的菌液稀釋涂平板做對照。將上述平板于45℃培養(yǎng)20 h后計數(shù)，并計算致死率。培養(yǎng)20 h后，挑出大、中、小菌落48個，分別培養(yǎng)后并測定釋放酶活，從中選出酶活最高的菌株。

1.2.3 酶液體深層發(fā)酵培養(yǎng)及分離 將液體試管菌種接入三角瓶液體培養(yǎng)基中，45℃搖瓶培養(yǎng)24～96 h，隨時觀察菌種生長情況，檢測菌密度和異淀粉酶活力。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)12 000 r/min離心過濾，上清即為粗酶液。酶液用硫酸銨沉淀，收集飽和度30%～80%的沉淀，經(jīng)0.1 M pH值6.2的醋酸鹽緩沖液透析后，得到初步純化的酶產(chǎn)品。

1.2.4 酶活力測定 α-淀粉酶活力測定[10-12]：取一定量的酶液稀釋至合適的濃度，與1%的可溶性淀粉（溶于0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液中）50℃反應(yīng)30 min，然后添加3，5—二硝基水楊酸顯色試劑（DNS），混勻后沸水浴5 min，立即冷卻。用0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋至合適的體積后，測540 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得水解產(chǎn)生的還原糖的量。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘水解淀粉生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（mL）為1 U。

異淀粉酶活力測定：取一定量的酶液稀釋至合適的濃度，與1%的普魯蘭（溶于0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液中）50℃反應(yīng)30 min，然后添加3，5—二硝基水楊酸顯色試劑（DNS），混勻后沸水浴5 min，立即冷卻。用0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋至合適的體積后，測540 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得水解產(chǎn)生的還原糖的量。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘水解淀粉生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（mL）為1 U。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種誘變酶活測定

初始菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌培養(yǎng)60～72 h，α-淀粉酶活力為1.0～1.5 U/mL，異淀粉酶活力為2.5～3.2 U/mL；經(jīng)誘變篩選獲得的變異菌株UM761培養(yǎng) 48～60 h，α-淀粉酶活力為 0.9～1.5 U/mL，異淀粉酶活力為5.5～9.6 U/mL。與初始菌株產(chǎn)酶活性比較，UM761酶活比初始菌株提高了2～3倍，培養(yǎng)時間縮短1/4，α-淀粉酶活力基本沒變。

2.2 UM761菌種產(chǎn)酶條件初步優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基不同碳源對產(chǎn)酶的影響 選擇葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉作為菌種培養(yǎng)碳源，其他培養(yǎng)基成份和培養(yǎng)條件都相同，根據(jù)培養(yǎng)時間測定培養(yǎng)液的菌密度和培養(yǎng)液中的酶活并與碳源進行比較，結(jié)果如圖1、圖2所示，葡萄糖和可溶性淀粉是較好的碳源。選擇培養(yǎng)基葡萄糖的濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%進行搖瓶培養(yǎng) 72 h，并測定培養(yǎng)液中酶活力，結(jié)果見表1，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度達到0.1%時，菌種生長及培養(yǎng)液中異淀粉酶生成可以達到最佳狀態(tài)。

圖1 不同碳源培養(yǎng)時間與細菌密度的關(guān)系

2.2.2 培養(yǎng)基不同氮源對產(chǎn)酶的影響 選擇牛肉汁、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母粉作為菌種培養(yǎng)氮源，其他基成份和培養(yǎng)條件都相同，根據(jù)培養(yǎng)時間測定培養(yǎng)液的菌密度和培養(yǎng)液中的酶活并與氮源進行比較，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖2 不同碳源培養(yǎng)時間與酶活力的關(guān)系

表1 培養(yǎng)基中葡萄糖濃度與菌種生長的關(guān)系

圖3 不同氮源培養(yǎng)時間與菌密度的關(guān)系

圖4 不同氮源培養(yǎng)時間與酶活力的關(guān)系

牛肉浸膏和酵母粉都是較好的氮源，酵母粉也可以促進菌種的快速生長和繁殖，但沒有促進酶分泌的作用。由于牛肉汁主要用新鮮肉制得，價格昂貴，不適宜用于實際生產(chǎn)，因此選用牛肉浸膏、蛋白胨和酵母粉的混合物作為菌種氮源，菌種的生產(chǎn)周期為72 h左右，培養(yǎng)液酶活力可達9.0 U單位以上。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶活性的影響 根據(jù)以上確定的培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)溫度分別為35、40、42、44、45、48、50、55℃進行三角瓶振蕩培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件都相同，根據(jù)培養(yǎng)時間測定培養(yǎng)液的菌密度和培養(yǎng)液中的酶活，結(jié)果如圖5、圖6所示，菌種最佳培養(yǎng)溫度為44～46℃。

圖5 不同培養(yǎng)溫度與菌密度的關(guān)系

圖6 不同培養(yǎng)溫度與酶活力的關(guān)系

2.2.4 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活性的影響 在最適培養(yǎng)條件下，每隔8 h測定培養(yǎng)液的酶活力，結(jié)果如圖7所示，在培養(yǎng)48 h時產(chǎn)酶活性最高，最終確定菌種最佳培養(yǎng)時間為48～64 h。

圖7 不同培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶活性的影響

2.2.5 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶活性的影響 配制不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基，同步發(fā)酵，測定菌密度與酶活。制作培養(yǎng)基初始pH值與產(chǎn)酶的關(guān)系曲線如圖8所示。由圖8可知，菌株可在廣泛的初始pH范圍內(nèi)發(fā)酵，在偏酸性近中性的環(huán)境中發(fā)酵的酶活均較高，pH值在6.2時酶活達到最高，菌種培養(yǎng)最佳初始pH為6.2～6.5。

圖8 不同初始pH值對產(chǎn)酶活性的影響

2.2.6 金屬離子對產(chǎn)酶活性的影響 在酶反應(yīng)系統(tǒng)中分別添加終濃度為 10 mmol的 Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+、PO43-、HPO43-、EDTA，在最適培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，以不添加金屬離子酶活性為100%，計算酶的相對活性。結(jié)果如表2所示，Co2+、Mg2+、Ca2+對異淀粉酶有較強的激活作用，而Fe3+、Fe2+對酶則有較強的抑制作用，異淀粉酶在磷酸鹽中很穩(wěn)定。

表2 金屬離子對酶活力的影響

3 討論

微生物所產(chǎn)的淀粉酶在淀粉工業(yè)運用中具有舉足輕重的作用，可以與α-淀粉酶、β-淀粉酶等水解酶相互協(xié)同，提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，并有效地增加出糖率。嗜熱的異淀粉酶市場需求大，產(chǎn)品附加值高，投資回報率高，特別是嗜熱異淀粉酶工程菌的開發(fā)和應(yīng)用，將填補國內(nèi)空白，對增加我國酶制劑行業(yè)的品種，促進國內(nèi)生物酶高新技術(shù)的研發(fā)，提高淀粉的附加值，降低生產(chǎn)成本，增加企業(yè)的經(jīng)濟效益等都有重要的意義。研究選取嗜熱脂肪芽孢桿菌進行產(chǎn)異淀粉酶菌種誘變，與原始菌株相比，誘變所獲得的UM761菌株產(chǎn)酶效率提高了2～3倍。在此基礎(chǔ)上，筆者對此菌株的產(chǎn)酶條件做了優(yōu)化，最適產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)條件為以1%葡萄糖作為碳源，牛肉膏，蛋白胨和酵母粉的混合物作為氮源，溫度44～46℃，培養(yǎng)時間48～64 h，培養(yǎng)基初始pH值6.2～6.5。同時研究了金屬離子對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果表明Co2+、Mg2+、Ca2+對異淀粉酶有較強的激活作用，而Fe3+、Fe2+對異淀粉酶則有較強的抑制作用，而異淀粉酶在磷酸鹽中很穩(wěn)定。

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