禁食不同時(shí)段下丘腦穹窿周區(qū)orexin－A的表達(dá)

趙 琳 賈鯤鵬 史 娟 苗乃周＊ 王 璐

（1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室；2延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 716000；3第四軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，西安 710032）

增食欲素（orexin）是由下丘腦外側(cè)區(qū)（later hypothalamus area，LHA）合成和分泌的具有神經(jīng)興奮作用的多肽，是1998年Sakurai等［1］在大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，它包括兩個(gè)單體orexin－A和orexin－B，orexin－B為一線性多肽，而orexin－A具有二硫鍵環(huán)化多肽，具有更穩(wěn)定的生化結(jié)構(gòu)，在生物學(xué)重要性方面比orexin－B更重要。近年的研究表明orexin系統(tǒng)，尤其是orexin－A，具有廣泛的生理作用，參與攝食、能量代謝、睡眠－覺醒等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)［2］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦室內(nèi)注射orexin－A能明顯增加實(shí)驗(yàn)大鼠的攝食行為，表明orexin－A與攝食密切相關(guān)。研究者常采用禁食來研究orexin的激活和變化規(guī)律，但禁食多長時(shí)間效果最好并無報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色和灰度測量方法，觀察禁食不同時(shí)段大鼠下丘腦穹窿周區(qū)orexin－A的表達(dá)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

實(shí)驗(yàn)采用Sprague Dawley大鼠（由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）24只（雄性，體重150－180g），隨即分為4組，每組6只。一組為正常對照組，開始禁食時(shí)即灌注固定。另外三組分別禁食24h，48h和72h，動(dòng)物自由飲水，存活相應(yīng)的時(shí)間段后灌注固定。

2.大鼠一般情況觀察

包括毛色、皮膚顏色、活動(dòng)情況和反應(yīng)靈敏度等，禁食組大鼠分別于禁食開始及禁食結(jié)束時(shí)各稱體重一次。

3.灌注和取材

各組大鼠戊巴比妥鈉（80mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注100ml生理鹽水，繼以400ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）灌注固定，持續(xù)1h左右后，取腦，置入含30%蔗糖的PB中4℃過夜。待腦組織沉底后取下丘腦部分行冰凍切片，片厚30μm。

4.免疫組化染色

切片經(jīng)0.01mol/L PBS（pH 7.4）常規(guī)漂洗后，入0.3%H2O2以消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉液（博士德公司）室溫封閉1h，再依次進(jìn)行以下處理：小鼠抗orexin－A IgG（1∶1000，Abcam），室溫過夜；生物素化驢抗小鼠血清（1∶200，Chemicon），室溫孵育4－6h；AB復(fù)合物（1∶200，Vector），室溫孵育1－2h。以上各步之間均用PBS充分漂洗切片。以上抗體除AB復(fù)合物用含0.3%Triton X－100的PBS稀釋外，其余均用含0.25%角叉菜膠，0.3%Triton X－100，0.05%NaN3和3%山羊血清的PBS稀釋。最后切片常規(guī)DAB呈色、裱片、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、封片后，明視野顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)和拍照。

5.灰度值測量和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各只動(dòng)物orexin－A陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)和灰度值測量均選取3張典型切片進(jìn)行，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)（Image－Pro Plus）進(jìn)行處理。用photoshop分析工具對神經(jīng)元內(nèi)orexin－A免疫陽性產(chǎn)物的灰度進(jìn)行測量。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，采用SPSS13.0軟件，行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一般情況

動(dòng)物在禁食期間未出現(xiàn)明顯異常，禁食24h和禁食48h大鼠毛色正常，無脫毛，反應(yīng)能力、活動(dòng)情況等比較正常。禁食72h組大鼠在禁食末期懶于活動(dòng)，對刺激反應(yīng)遲鈍，毛色灰暗，無光澤，但無脫毛。大鼠體重隨禁食時(shí)間的延長而逐漸降低，各組大鼠禁食前后體重變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠禁食前后體重變化（±s）Table1 The changes of the body weight of rats before and after fasting in each group（±s）

表1 各組大鼠禁食前后體重變化（±s）Table1 The changes of the body weight of rats before and after fasting in each group（±s）

＊P＜0.01vs before fasting

組別Groups 禁食前體重（g） The body weight before fasting 禁食后體重（g） The body weight after fasting 24h 173.35±9.24 165.42±8.96＊48h 175.25±8.54 160.88±8.62＊72h 172.54±10.04 144.25±9.84＊

2.免疫組化染色

對照組和禁食組的orexin－A的免疫陽性產(chǎn)物分布相似，主要分布于穹隆周區(qū)、下丘腦腹外側(cè)、背側(cè)、后側(cè)區(qū)，以穹窿周區(qū)最為密集（圖1）。細(xì)胞呈卵圓形和三角形，胞體及突起輪廓清楚。各只動(dòng)物orexin－A陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)，均選取穹隆周區(qū)陽性產(chǎn)物最為密集的3張進(jìn)行，計(jì)算出陽性細(xì)胞均數(shù)。禁食24h、48h和72h組orexin－A神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯多于對照組（P＜0.05），但不同禁食組間orexin－A神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 Orexin－A在下丘腦穹窿周區(qū)的表達(dá)，A.對照組；B.禁食24h；C.禁食48h；D.禁食72h；3v第三腦室；f穹窿.標(biāo)尺＝200μm.Fig.1 Immunohistochemical staining of orexin－A in perifornical hypothalamus，Bar＝200μm.A.control group；B.fasting for 24h；C.fasting for 48h；D.fasting for 72h.3V：the third ventricle；f：fornix.

3.灰度值測量

Orexin－A陽性神經(jīng)元平均灰度值分析結(jié)果顯示，禁食24h組的灰度值與對照組相比有所下降，禁食48h組的灰度值最低，顯示orexin－A免疫染色強(qiáng)度最高；禁食72h組的灰度值有所回升（圖2）。禁食48h組與正常對照組、禁食24h和禁食72h組灰度值比較有明顯變化（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組間orexin－A陽性神經(jīng)元灰度值比較Fig.2 Comparison of grey value for orexin－A immunopositive neurons in four different groups.Con，control；24，48，72h，fasting for 24h，48 h，72hgroups respectively.＊P＜0.05，compared with control，24h，72hgroup respectively.

討 論

下丘腦是重要的皮質(zhì)下中樞，是動(dòng)物調(diào)節(jié)攝食活動(dòng)的關(guān)鍵部位［3］。Orexin神經(jīng)元胞體對稱地，不連續(xù)地分布于下丘腦背側(cè)、后側(cè)、外側(cè)及穹隆周區(qū)。應(yīng)用腦區(qū)損傷的研究證實(shí)：內(nèi)側(cè)區(qū)的弓狀核（arcuate hypothalamic nucleus，ARC）、腹內(nèi)側(cè)核（VMN）、背內(nèi)側(cè)核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMN）、室旁 核 （paraventricular hypothalamic nucleus，PVN）、視 交 叉 上 核 （suprachiasmatic nucleus，SChN）和下丘腦外側(cè)區(qū)（lateral hypothalamic area，LHA）皆可影響攝食行為，是下丘腦食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的“網(wǎng)絡(luò)中心”［4］。攝食調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)調(diào)性攝食活動(dòng)是維持動(dòng)物生命的基本生理活動(dòng)。下丘腦外側(cè)區(qū)是攝食中樞，這個(gè)部位損傷可抑制進(jìn)食，使體重下降，這表明該區(qū)域是調(diào)節(jié)進(jìn)食和能量平衡的關(guān)鍵部位。

禁食可上調(diào)下丘腦orexin mRNA，也上調(diào)orexin免疫反應(yīng)神經(jīng)元中cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化形式，顯示了orexin對攝食狀態(tài)的功能性應(yīng)答。用orexin受體拮抗劑能使大鼠攝食量顯著減少，也能抑制orexin引起的增食效應(yīng)［5］，表明orexin是一種促進(jìn)攝食的增食因子。進(jìn)一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，給大鼠側(cè)腦室、DMN、PVN、LHA和穹隆周區(qū)注射orexin－A，可顯著提高其進(jìn)食量，并可引發(fā)動(dòng)物與期待攝食相關(guān)的行為學(xué)表現(xiàn)［6，7］。Mondal等［8］觀察到禁食48h后，與對照組比較，大鼠下丘腦外側(cè)orexin－A含量上升。本文選擇了分別禁食24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間段來研究下丘腦orexin－A的表達(dá)變化，并進(jìn)行對比分析。

本實(shí)驗(yàn)中，所有大鼠禁食結(jié)束后全部存活，禁食期間，各組大鼠無特殊異常表現(xiàn)，其中禁食72h組大鼠，在禁食末期懶于活動(dòng)，對刺激反應(yīng)遲鈍，毛色灰暗，無光澤?？赡苁莿?dòng)物在饑餓狀態(tài)下維持基本生命功能的適應(yīng)性反應(yīng)。由于沒有能量補(bǔ)充，大鼠體重隨禁食時(shí)間的延長而逐漸降低，平均每24h減少7－10g，說明禁食可以明顯降低大鼠體重。Orexin－A的免疫陽性產(chǎn)物主要分布于穹隆周區(qū)、下丘腦腹外側(cè)、背側(cè)、后側(cè)區(qū)，以穹窿周區(qū)最為密集。禁食24h、48h和72h組orexin－A神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯多于正常對照組（P＜0.05），說明禁食刺激促進(jìn)了orexin－A的表達(dá)，但不同禁食組間orexin－A神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較沒有明顯改變。禁食時(shí)，下丘腦“攝食中樞”及相關(guān)核團(tuán)的活動(dòng)因饑餓明顯增強(qiáng)，相應(yīng)的促食欲因子的合成、運(yùn)輸和釋放也應(yīng)明顯增加。進(jìn)一步的灰度測量顯示，禁食48horexin－A陽性神經(jīng)元灰度值最低，免疫染色強(qiáng)度最高，與對照組、禁食24h和禁食72h組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。禁食24h、禁食72 h組和對照組灰度值相近，但之間比較并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明禁食48h對于orexin－A神經(jīng)元的活化可能是一個(gè)比較適宜的刺激。Orexin－A系統(tǒng)雖然胞體分布局限，但其纖維向全腦廣泛投射，orexin－A可能通過這種廣泛腦區(qū)的協(xié)同作用，參與攝食及能量代謝的調(diào)節(jié)。

［1］Sakurai T，Amemiya A，Ishii M，et al.Orexins and orexin receptors：a family of hypothalamic neuropeptides and G protein－coupled receptors that regulate feeding behavior.Cell，1998，92（4）：573－585

［2］Sakurai T.Roles of orexins and orexin receptors in central regulation of feeding behavior and energy homeostasis.CNS Neurol Disord Drug Targets，2006，5（3）：313－325

［3］Kotz CM.Integration of feeding and spontaneous physical activity：role of orexin.Physiol Behav，2006，88（3）：294－301

［4］Abizaid A，Horvath TL.Brain circuits regulating energy homeostasis.Regul Pept，2008，149（1－3）：3－10

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［6］Okumura T，Takakusaki K.Role of orexin in central regulation of gastrointestinal functions.J Gastroenterol，2008，43（9）：652－660

［7］Greco MA，Shiromani PJ.Hypocretin receptor protein and mRNA expression in the dorsolateral pons of rats.Brain Res Mol Brain Res，2001，88（1－2）：176－182

［8］Mondal MS，Nakazato M，Date Y，et al.Widespread distribution of orexin in rat brain and its regultion upon fasting.Biochem Biophys Res Commun，1999，256（3）：495－499