冠狀病毒疫苗研究進(jìn)展及2019新型冠狀病毒疫苗研發(fā)展望

張明順，吉寧飛

1南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，2國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)抗體技術(shù)實(shí)重點(diǎn)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

2019年12月，新型冠狀病毒（2019 novel corona?virus，2019?nCoV）從武漢海鮮市場(chǎng)開始在人群中擴(kuò)散［1］，截止2020年2月19日24時(shí)，2019?nCoV感染累計(jì)確診74576 例，死亡2118 例（信息來自國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)官方網(wǎng)站）。中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將2019?nCoV 引起的疾病統(tǒng)稱為新型冠狀病毒肺炎。世界衛(wèi)生組織（WHO）將2019?nCoV 引起的疾病稱為2019 冠狀病毒?。╟oronavirus disease 2019，COVID?19）［2］；2019?nCoV 可能不僅僅引起肺部損害，還可能引起消化道感染［3］和其他臟器損傷。世界病毒分類委員會(huì)將2019?nCoV命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syn?drome coronavirus 2，SARS?CoV?2）［4］。國(guó)內(nèi)外對(duì)于將2019?nCoV命名為SARS?CoV?2尚有一定爭(zhēng)議，建議修正為2019 人類冠狀病毒（human coronavirus 2019，HCoV?19）［5］。本文用2019?nCoV 指代2019新型冠狀病毒。

冠狀病毒是單正鏈RNA包膜病毒，廣泛存在于自然界中。人類冠狀病毒如229E、OC43、NL63 和HKU1 等一般引起輕中度的呼吸道感染癥狀［6］。2002 年，嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respira?tory syndrome，SARS）冠狀病毒（SARS?CoV）在國(guó)內(nèi)爆發(fā)［7］，WHO 估計(jì)SARS 確診8098 例，死亡774 例，病死率近10%［8］。2012年，中東呼吸綜合征（middle east respiratory syndrome，MERS）冠狀病毒（MERS?CoV）在沙特等地爆發(fā)［9］，WHO估計(jì)MERS確診1879例，死亡659 例，病死率高達(dá)35%［10］。不同于SARS和MERS 癥狀典型，2019?nCoV 感染后部分感染者無癥狀，無癥狀感染者影響了對(duì)2019?nCoV 病死率的估算。在1099例病原學(xué)確診病例中，死亡15例，病死率1.4%［11］，低于SARS或者M(jìn)ERS。

傳染性疾病的防控三原則是控制傳染源、阻斷傳播途徑和保護(hù)易感者。疫苗是保護(hù)易感者、阻斷傳染性疾病傳播的有效手段，疫苗的發(fā)展和應(yīng)用是現(xiàn)代文明的重要特征。從疫苗的組成和工作原理區(qū)分，疫苗有多種類型：傳統(tǒng)疫苗（滅活疫苗、減毒活疫苗）、亞單位疫苗、重組載體疫苗、DNA 疫苗以及RNA疫苗等。本文旨在回顧SARS?CoV和MERS?CoV 傳統(tǒng)疫苗、亞單位疫苗和DNA 疫苗研究進(jìn)展，并以此展望2019?nCoV疫苗研究。

1 滅活疫苗

2002 年11 月，SARS 爆發(fā)；2003 年4 月，分離得到SARS?CoV 病毒株［12］。2004 年9 月，暨南大學(xué)報(bào)道，福爾馬林滅活疫苗接種Balb/c小鼠，誘導(dǎo)出高滴度SARS?CoV 抗體［13］。2005 年5 月，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所報(bào)道，應(yīng)用福爾馬林滅活的SARS?CoV 疫苗接種獼猴，可以安全有效地誘導(dǎo)出中和抗體。但遺憾的是，SARS?CoV 獼猴感染模型癥狀不典型，實(shí)驗(yàn)沒有能夠回答滅活疫苗是否有保護(hù)效果［14］。2007年2月，北京中日友好醫(yī)院報(bào)道，β?丙醇酸內(nèi)酯滅活的SARS?CoV 疫苗接種健康受試者后，可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答［15］。雪貂是流感病毒研究的模式動(dòng)物，感染SARS?CoV 后，雪貂出現(xiàn)發(fā)熱、流鼻涕和噴嚏等SARS典型癥狀。在雪貂感染冠狀病毒模型中，福爾馬林滅活疫苗可以誘導(dǎo)出SARS?CoV抗體，疫苗接種動(dòng)物的排毒時(shí)間縮短1 周［16］。與SARS?CoV疫苗研究歷程類似，2012年MERS爆發(fā)，2016年MERS?CoV 滅活疫苗接種小鼠［17］，雖然滅活疫苗成功誘導(dǎo)出中和抗體，但是滅活疫苗接種后的小鼠，肺臟出現(xiàn)超敏反應(yīng)損傷，提示滅活疫苗可能不是有效防控MERS 的候選疫苗。2020 年1 月24 日，浙江省疾病控制中心分離得到2019?nCoV病毒株。病毒株分離成功，給傳統(tǒng)疫苗（滅活疫苗、減毒活疫苗）的制備帶來了曙光。

雖然目前2019?nCoV 的免疫發(fā)病機(jī)制尚不明確，但我國(guó)有SARS 滅活疫苗研發(fā)的豐富經(jīng)驗(yàn)。在分離出2019?nCoV 病毒株的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)該嘗試2019?nCoV 滅活疫苗方案，包括：（1）分離更多的2019?nCoV病毒株進(jìn)而選擇合適的病毒株作為疫苗株；（2）建立病毒的大規(guī)模培養(yǎng)及滅活方案；（3）免疫佐劑的使用及小鼠等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證安全性和免疫原性。2019?nCoV滅活疫苗是否能夠安全有效的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，尚需臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 亞單位疫苗

滅活疫苗成分復(fù)雜，含有病毒體的多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。亞單位疫苗組成簡(jiǎn)單，一般僅含有一種或者幾種病毒蛋白，不需要病毒的培養(yǎng)與滅活，生物安全性相對(duì)更高。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）亞單位疫苗通過重組病毒蛋白乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）可誘導(dǎo)中和抗體，HBsAg亞單位疫苗接種有效阻斷了HBV在中國(guó)的傳播，證明了亞單位疫苗的免疫效果。

冠狀病毒重要結(jié)構(gòu)蛋白刺突蛋白（spike，S），與病毒進(jìn)入易感細(xì)胞密切相關(guān)，其近N端的S1功能結(jié)構(gòu)域含有受體結(jié)合區(qū)（receptor binding domain，RBD），與細(xì)胞表面的血管緊縮素轉(zhuǎn)化酶2（angioten?sin?converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合，通過近C 端的S2 功能結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜融合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。與SARS?CoV 比較，2019?nCoV 的S 蛋白尤其是RBD 有4 個(gè)氨基酸突變，但S 蛋白仍可與ACE2 有效結(jié)合［18］。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，ACE2是2019?nCoV的識(shí)別受體［19］。冷凍電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，2019?nCoV的S蛋白胞外區(qū)結(jié)構(gòu)與SARS?CoV 高度相似［20］，但2019?nCoV 的S 蛋白與ACE2 的結(jié)合力更高，這可能是2019?nCoV高傳染性的原因之一。遺憾的是，SARS?CoV的中和抗體S230等不能有效結(jié)合2019?nCoV的S 蛋白，提示解析2019?nCoV 的S 蛋白中和表位、研發(fā)S蛋白亞單位疫苗的必要性。

SARS?CoV 主要有S 蛋白、膜蛋白（membrane，M）、核衣殼蛋白（nuclear，N）和以及3a 蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白［21］。M 蛋白和3a 蛋白也可以誘導(dǎo)中和抗體，N蛋白可以通過交叉提呈誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化。需要注意的是，病毒蛋白具有多種生物學(xué)功能，如3a 蛋白可以下調(diào)Ⅰ型IFN 通路降低抗病毒免疫［22］，活化炎癥小體增強(qiáng)炎癥性損傷。根據(jù)基因組測(cè)序信息，2019?nCoV 可能包括S 蛋白、M 蛋白、N 蛋白、E 蛋白以及1ab/3/7/8/9/10b/13/14 等12 種結(jié)構(gòu)蛋白［23］。針對(duì)這些結(jié)構(gòu)蛋白功能與免疫原性進(jìn)一步分析，將有助于2019?nCoV亞單位疫苗的研發(fā)。

3 DNA疫苗

相較于亞單位疫苗，DNA疫苗在體內(nèi)表達(dá)病毒蛋白抗原，模擬了病毒蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，可以更好地保持病毒蛋白的天然構(gòu)象表位。DNA疫苗在宿主細(xì)胞中表達(dá)病毒蛋白，可以誘導(dǎo)相對(duì)平衡的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。傳統(tǒng)疫苗需要培養(yǎng)完整的病毒顆粒，亞單位疫苗則需要表達(dá)和純化目的蛋白，而DNA疫苗只需要制備含有抗原基因序列的表達(dá)質(zhì)粒，制備工藝簡(jiǎn)單。早于SARS?CoV 滅活疫苗（2004 年9 月）［13］，2004 年4 月已有研究報(bào)道，編碼SARS?CoVS蛋白的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和中和抗體［24］。更重要的是，在SARS?CoV攻毒實(shí)驗(yàn)中，接種DNA疫苗小鼠體內(nèi)的SARS?CoV 基本被完全清除，顯示DNA 疫苗具有強(qiáng)大的保護(hù)效果。2008年11月，SARS?CoVS蛋白DNA疫苗在I期臨床實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)出保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答和中和抗體［25］。SARS?CoV的結(jié)構(gòu)蛋白，如N蛋白和M蛋白等，在DNA疫苗研究中也有報(bào)道［8］。有趣的是，M 蛋白能比S 蛋白更有效地誘導(dǎo)中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答。MERS?CoVS 蛋白DNA 疫苗是首個(gè)進(jìn)入Ⅰ期臨床的MERS 疫苗，研究結(jié)果顯示其在小鼠、駱駝和獼猴中具有較好的免疫原性，并在肺部感染模型中能夠保護(hù)獼猴不受MERS病毒感染的影響［26］。Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分受試者能夠檢測(cè)到疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，不良反應(yīng)輕微且自限［27］。

制備2019?nCoV DNA 疫苗需有兩個(gè)重要前提；第一是基因組信息，尤其是病毒蛋白基因編碼序列；第二是病毒的生物學(xué)特征和疾病的發(fā)病機(jī)制。2019?nCoV病毒的生物學(xué)特征和疾病發(fā)病機(jī)制的闡明，有助于指導(dǎo)選擇病毒蛋白作為適合的DNA疫苗抗原。隨著209?nCoV 的生物學(xué)特征和疾病發(fā)病機(jī)制研究的深入，同時(shí)參考SARS?CoV 和MERS?CoV疫苗的研究經(jīng)驗(yàn)，我們可以優(yōu)先選擇S 蛋白和（或）M 蛋白、N 蛋白等制備單價(jià)或者多價(jià)DNA 疫苗。目前分離得到的2019?nCoV不同病毒株的基因組序列高度一致。隨著感染在人群中的不斷擴(kuò)散和可能發(fā)生的病毒免疫逃逸，2019?nCoV 是否會(huì)發(fā)生突變進(jìn)而改變靶抗原的免疫原性？參考HIV?1 DNA 疫苗研究經(jīng)驗(yàn)［28］，可以考慮在2019?nCoV DNA 疫苗中包括多個(gè)冠狀病毒株的S蛋白編碼序列從而更好地誘導(dǎo)廣譜中和抗體。

4 對(duì)2019新型冠狀病毒疫苗研發(fā)的思考與展望

4.1 安全性和有效性

對(duì)疫苗接種安全性的擔(dān)憂，首先來自于疫苗本身。滅活疫苗，接種劑量大，可能會(huì)引起發(fā)熱等；減毒活疫苗，在接種體內(nèi)復(fù)制，可能在免疫功能異常個(gè)體引起嚴(yán)重后果。在Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中，健康志愿者可以耐受SARS?CoV 滅活疫苗［15］，提示冠狀病毒滅活疫苗是安全的。2019?nCoV 與SARS?CoV 親緣關(guān)系近，即便如此，在獲得2019?nCoV滅活疫苗安全有效的直接證據(jù)之前必須時(shí)刻謹(jǐn)慎。亞單位疫苗是在體外表達(dá)、純化的病毒蛋白，不利于保持蛋白的構(gòu)象表位；且亞單位疫苗一般免疫原性比較弱。對(duì)于DNA疫苗安全性最大的擔(dān)憂，來自于其可能隨機(jī)整合到宿主基因組上。近30年的DNA 疫苗研究已經(jīng)充分證明了DNA 疫苗人群接種的安全性。DNA疫苗在人體內(nèi)的免疫效果比較弱，采用DNA疫苗初次免疫、蛋白質(zhì)疫苗加強(qiáng)免疫等免疫策略，可以有效增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫效果［28］。DNA 疫苗與亞單位疫苗的聯(lián)合應(yīng)用，或許是2019?nCoV 疫苗的研究方向之一。

2019?nCoV 患者的血清中含有能阻斷病毒感染的中和抗體［19］；康復(fù)期患者血漿能夠快速降低2019?nCoV 患者病毒載量，有效緩解臨床癥狀。但是，疫苗接種后引起的免疫應(yīng)答也是雙刃劍，抗體既可能結(jié)合病毒受體阻斷病毒傳播，也可能結(jié)合Fc受體促進(jìn)病毒感染，如SARS?CoV的S蛋白單克隆抗體可促進(jìn)巨噬細(xì)胞感染［29］；貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV，貓冠狀病毒）S蛋白的單克隆抗體可能促進(jìn)病毒巨噬細(xì)胞感染［30］；MERS?CoV 滅活疫苗誘導(dǎo)超敏反應(yīng)而加重肺部損害［17］。隨著對(duì)2019?nCoV 致病機(jī)制的進(jìn)一步了解，將有助于選擇更安全有效的疫苗株和靶抗原。

4.2 牛痘苗是否有助于2019 新型冠狀病毒疫苗的研究

歷史上最成功的疫苗是牛痘苗，消除了人間天花病毒的傳播。牛痘苗的本質(zhì)是感染牛的天花病毒，具有種屬特異性。牛痘苗誘導(dǎo)交叉性保護(hù)免疫應(yīng)答，受試者獲得抵抗天花病毒感染的免疫保護(hù)力。在動(dòng)物中，也有各種冠狀病毒［31］，如FIPV、血凝性腦脊髓炎病毒（hemagglutinating encephalomyelitis virus，HEV，豬冠狀病毒）、傳染性支氣管炎病毒（in?fectious bronchitis virus，IBV，禽冠狀病毒）以及小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV，鼠冠狀病毒）。這些動(dòng)物冠狀病毒也有種屬特異性。人類與貓/豬等共存了千年，F(xiàn)IPV/HEV 等的安全性是否與牛痘苗相當(dāng)？更關(guān)鍵的是，F(xiàn)IPV/HEV 是否可能會(huì)誘導(dǎo)交叉性保護(hù)應(yīng)答?目前動(dòng)物冠狀病毒減毒疫苗已經(jīng)在畜牧業(yè)中得到了有效應(yīng)用，這些冠狀病毒減毒疫苗是否有助于對(duì)阻斷2019?nCoV傳播？這些問題值得進(jìn)一步探討。

4.3 2019?nCoV疫苗何時(shí)問世

雖然2019?nCoV 尚未構(gòu)成世界疫情大流行，但是其傳播性已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了SARS?CoV。2004年之后，SARS 僅有新加坡的實(shí)驗(yàn)室感染報(bào)道［32］。SARS“消失”了，完成了Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)的SARS?CoV 滅活疫苗因此也失去了歷史使命。鑒于2019?nCoV 與SARS?CoV的親緣關(guān)系，塵封已久的SARS?CoV滅活疫苗是否可以誘導(dǎo)出針對(duì)2019?nCoV的交叉免疫保護(hù)還有待進(jìn)一步研究。如果直接使用SARS?CoV滅活疫苗來預(yù)防2019?nCoV，那么疫苗的研制和臨床應(yīng)用將是最快捷的。否則，從SARS和MERS疫苗的研究歷史來看，2019?nCoV 疫苗必須歷經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)，不可能一蹴而就。從2002 年SARS 爆發(fā)近20 年來，中國(guó)的科研能力已得到長(zhǎng)足發(fā)展，相信并期待科研工作者能早日成功研制出2019?nCoV疫苗，為我們戰(zhàn)勝2019?nCoV傳播提供戰(zhàn)略性武器。