外泌體在中樞神經細胞間的信息交流作用及在神經退行性疾病中的功能

孫振杰，黃正千，吳茂東，徐英達，蔡增林*

1南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院（西區(qū)）神經內科，江蘇 蘇州 215000；2蘇州科技城醫(yī)院神經內科，江蘇 蘇州 215000

1 外泌體的一般特性

1.1 外泌體的生物起源和歷史

外泌體（exosomes）有多種分泌機制，經典的途徑為轉運必需內體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）途徑，ESCRT途徑多囊泡體（multivesicular body，MVB）的形成主要由ESCRT、泛素化蛋白和Vps4 的相繼協(xié)同作用于內吞體膜上，而這些多囊泡體一部分被運送到溶酶體，另一部分與質膜融合并釋放到細胞外發(fā)揮作用，就是外泌體。另一種重要的機制為四跨膜蛋白途徑，四跨膜蛋白由多種蛋白組成，如前黑色素小體蛋白、淀粉樣蛋白。Johnstone等［1］在1983年首次報告了在綿羊紅細胞上清液中發(fā)現(xiàn)了一種囊泡小體，其直徑約30～100 nm，密度為1.1～1.2 g/mL，并將其命名為外泌體。外泌體本質為一種脂質雙分子囊泡［2］，可由內皮細胞、免疫細胞如T淋巴細胞、神經細胞等絕大多數細胞分泌。而在其他體液中如血液、尿液、唾液甚至乳汁、胸腔積液、羊水及腹水等都能檢測到外泌體。研究人員最開始認為外泌體是網織紅細胞在成熟過程中為了清除細胞碎片和細胞表面分子而產生的細胞器。隨著研究的進一步進展，Rapo?so［3］在1996 年發(fā)現(xiàn)，外泌體不但可以刺激T細胞增殖、起到抗原提呈作用，還能夠誘導機體免疫反應、改變細胞外微環(huán)境及影響機體健康，此發(fā)現(xiàn)使外泌體得到廣泛關注。2007年Valadi等［4］首次報道外泌體中含有RNA后，使人們進一步了解了外泌體的組成和功能，為控制疾病提供了新思路，為研究生物醫(yī)藥提供了新方法。

1.2 外泌體的組成及其成分的功能

外泌體的內容物主要為蛋白、脂質、核酸3大類物質。目前已經發(fā)現(xiàn)不同來源的外泌體含有超過1萬種不同的蛋白［5-6］。外泌體中最常被鑒定含有的蛋白質為熱休克蛋白（如HSP70、HSP90）、融合蛋白（如flotillin、annexins、GTPases）、四跨膜蛋白超家族成員tetraspanins（如CD9、CD63、CD81、CD82）以及膜轉運蛋白。外泌體同樣含有豐富的脂類物質，包括磷脂酰類、神經酰胺類、鞘磷脂和膽固醇等，其脂質雙層膜含磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、神經酰胺、膽固醇等。外泌體的來源不同，其脂類的組成成分也不同。最主要的功能是可以在運輸過程中保護內含物的穩(wěn)定性，在遠距離、長時間的運輸后，也能保持有效的生物活性。外泌體之所以和其他囊泡不同最主要的原因是外泌體含有遺傳物質，自從2014年首次報道微小RNA（microRNA，miRNA）存在于外泌體以來［7］，已經發(fā)現(xiàn)了外泌體至少含有2 000多種miRNA。

外泌體所含的蛋白質以及肽物質可以作為分子標記物，如抗原遞呈細胞分泌的外泌體表達主要組織相容性共同刺激蛋白類；腸上皮細胞的外泌體均含有消化酶；來自血小板的外泌體上有整合蛋白CD41a。外泌體在運輸過程中保護其內含物在遠距離、長時間的運輸后，也能保持有效的生物活性則靠其含有的脂質成分。而外泌體中miRNA的作用是完成基因的水平轉移和蛋白質的翻譯。

1.3 外泌體的提取與鑒定

外泌體的提取方法主要有離心法、免疫磁珠法、色譜法、但是受技術和研究的限制，不管使用哪種方法都不能保證外泌體提取的純度。離心法中過濾離心法和密度離心法［8］最為常用。過濾離心法顧名思義是利用過濾膜分離不同分子質量的組分［9］，密度離心法則是利用組分間密度不同的原理對待測物質進行提純。免疫磁珠法是先將某種特使物質與待測物質結合，然后對組合物質進行提?。?0］。色譜法也是一種比較重要的方法，主要利用待測物質不同成分分子的大小與凝膠孔徑的差異進行提取［11］。

目前只能使用電子顯微鏡來觀察外泌體，因為外泌體為一種納米級囊泡狀結構。但是由于外泌體的內容物和質膜上含有豐富的脂質，且外泌體含有某些特殊的標志性蛋白，如TSG101、CD81、CD63等，所以可以用特殊的方法觀察和鑒定外泌體，如ELISA法或者蛋白印跡法。

2 外泌體的信息交流方式

細胞與細胞之間通訊的方式有多種，主要為化學信號分子途徑介導的分泌（自分泌、旁分泌）方式和接觸（細胞間突觸接觸、細胞直接接觸）方式。最近研究發(fā)現(xiàn)，因為含有蛋白質和核酸外泌體作為一種新的細胞通訊方式在物質交換和物質運輸方面也起到了重要作用。外泌體介導的信息交流方式主要有3 種，即依賴于膜融合后的內容物釋放進行信息轉運、依賴于膜表面信號分子的信息轉運以及依賴于信號分子的胞外釋放進行信息轉運。

表面信號分子的直接作用是最早被發(fā)現(xiàn)的信息交流方式，國外的一項研究發(fā)現(xiàn)人體細胞可以捕捉動物肥大細胞釋放的外泌體，通過直接接觸的方式使miRNA先進入細胞質，再被翻譯成蛋白質。進一步研究表明，外泌體攜帶的miRNA也可以完成基因的水平轉移和蛋白質的翻譯［12］，這是人們第一次發(fā)現(xiàn)外泌體基于基因水平的信息交流，是細胞間通訊的一個重要發(fā)現(xiàn)。外泌體以一種類似于病毒感染的方式通過細胞間信號分子直接接觸在人體的多種細胞間進行物質運輸，從而發(fā)揮各種作用，如對腫瘤細胞免疫抑制作用［13］，對血管內皮細胞抗動脈粥樣硬化作用［14］，調節(jié)脂肪在脂肪細胞中合成［15］，干細胞的心肌保護作用［16］、神經保護作用［17］等。通過膜融合轉運遺傳物質是目前外泌體最具有吸引力的研究領域。研究發(fā)現(xiàn)外泌體還可以通過生物活性成分的胞外釋放作用于細胞膜表面受體，完成細胞間交流。在應激或特定環(huán)境的刺激下，神經膠質細胞為了保護神經元的穩(wěn)定性，其外泌體分泌的突觸素與神經元表面黏附分子受體結合，從而保護腦組織［18］。除了以上兩種交流方式，外泌體作用于膜表面受體進行細胞通訊的方式也同樣重要，在機體生長發(fā)育過程中，細胞可以分泌表面帶有糖蛋白的外泌體作用于靶細胞表面受體，從而調節(jié)細胞分化［19］。這一發(fā)現(xiàn)同樣解決了長期以來人們對這種信號蛋白如何遠距離作用調控機體發(fā)育的困惑。

3 外泌體在中樞神經細胞間的信息交流作用

外泌體與傳統(tǒng)的神經細胞釋放的囊泡不同，外泌體攜帶各種活性物質，直接被釋放到細胞外，參與多類神經細胞與多種神經膠質細胞之間的物質交換和信息交流，在發(fā)揮突觸調節(jié)功能，促進神經系統(tǒng)發(fā)育和維持神經元穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［20］。

3.1 膠質細胞分泌外泌體與神經元進行信息交流

在維持中樞神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)時，神經膠質細胞分泌多囊泡體與神經元之間進行物質交換和信息交流。國外的一項研究提示，高濃度的突觸素有保護神經細胞和延遲神經退行性疾病進程的作用。在外界刺激如神經遞質、電活動作用下，星形膠質細胞釋放含有突觸素的外泌體與神經細胞表面的神經細胞黏附分子（NCAM）結合，從而保護神經細胞不受破壞。這些突觸素還可與神經細胞表面的受體結合維持神經元正常功能。除此之外，星形膠質細胞釋放的外泌體還可以促進神經系統(tǒng)的發(fā)育、維持神經細胞的穩(wěn)態(tài)以及影響神經元功能。其機制可能與星形膠質細胞被活化時，通過分泌含有多種miRNA分子的外泌體，作用于神經細胞有關［21-24］；除了星形膠質細胞以外，小膠質細胞來源的多囊泡體也影響著中樞神經系統(tǒng)的多種生理病理功能，既可以提高神經元的活性，又能夠加重神經炎癥反應。研究表明，小膠質細胞釋放的外泌體可以促進神經酰胺和鞘氨醇的代謝從而提高突觸活性，當小膠質細胞活化后，其分泌的多囊泡體作用于神經細胞質膜上，從而增加了興奮性突觸后電流頻率［25］。而活化的小膠質細胞也可以釋放外泌體擴大神經炎癥發(fā)生范圍并增加炎癥反應強度，當高ATP水平的組織細胞與小膠質細胞來源的外泌體相遇時，可以誘導這些多囊泡體釋放白細胞介素（IL）?1β 等炎癥因子，從而加速了炎癥的進展［26-28］。

3.2 神經元分泌外泌體與膠質細胞進行信息交流

相反，特定大腦區(qū)域神經元所分泌的囊泡同樣對膠質細胞信息交流、物質轉運起到了重要作用。研究表明，神經細胞來源的外泌體攜帶多種RNA通過內化作用直接進入星形膠質細胞并增加其谷氨酸轉運蛋白（glutamate transporter，GLAST）水平［29］，從而調節(jié)星形膠質細胞的功能。而大量的谷氨酸被星形膠質細胞的突起包繞，進一步促進了膠質細胞攝取這些多囊泡體。除此之外，小膠質細胞可以捕獲神經細胞分泌的外泌體，這些囊泡體被捕獲后立即被運送到溶酶體并被其降解，從而調節(jié)β淀粉樣蛋白的構象，形成無毒的淀粉樣蛋白纖維［30］。而在神經退行性疾病中，外泌體與疾病相關蛋白如淀粉狀蛋白β42（Aβ42）、α?突觸核蛋白（α?syn）、亨廷頓相關蛋白（HAP?1）的分泌都有關系，這些“有毒的”蛋白在逃脫自噬溶酶體系統(tǒng)降解之后，以外泌體的形式被神經元釋放到胞外被膠質細胞捕獲，但膠質細胞過度清除α?syn 反而會加速神經退行性改變［31］。

3.3 外泌體分別在神經元間和膠質細胞間進行信息交流

研究發(fā)現(xiàn)，神經細胞之間可以通過外泌體進行細胞通訊。Chivet 等［32］發(fā)現(xiàn)，當中樞神經系統(tǒng)受到刺激時，突觸離子型谷氨酸受體亞型N?甲基?D?天冬氨酸受體被激活，神經細胞釋放的外泌體含有synaptotagmin 蛋白，作用于其他神經元后可以調節(jié)軸突生長的逆行信號，且這些囊泡體優(yōu)先在突觸前部位結合［33］，證實外泌體參與突觸功能的調節(jié)。同樣，膠質細胞之間也可以通過外泌體參與物質交換和信息交流。當神經系統(tǒng)受到外界刺激如電刺激或者炎癥狀態(tài)，活化的星形膠質細胞釋放帶有活性因子的外泌體參與小膠質細胞介導的炎性反應，從而加重膠質細胞對機體的炎性損傷，并且延長損傷時間和擴大病變范圍。相反，少突膠質細胞分泌多囊泡體與小膠質細胞通訊反而抑制炎癥反應，F(xiàn)itzner 等［34］研究表明，大腦處于應激狀態(tài)時，小膠質細胞通過胞飲作用內化少突膠質細胞來源的外泌體，隨即小膠質細胞減少了促炎癥因子如腫瘤壞死因子、IL的釋放，從而參與炎癥反應的調節(jié)。

4 外泌體在常見神經退行性疾病中的分子標志作用

通常能夠在細胞、體液或組織中被檢測到的細胞來源的活性物質稱為分子標志物［35］。而對疾病療效進行評估、對生理病理學進行評價的生物分子現(xiàn)在也被稱作生物標志物。外泌體由于含有多種蛋白質和遺傳物質，特別是可以反映神經退行性疾病的標志性蛋白，使其越來越多地被應用為生物標志物上。而臨床上最常見的神經退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈癥。

阿爾茲海默癥公認的病理學特點為Aβ42 及磷酸化tau 蛋白在神經元和神經膠質細胞中的聚集。早在1970 年就有研究發(fā)現(xiàn)外泌體在阿爾茲海默癥患者的神經元中大量增加，而在這些MVB 中，檢測到了Aβ42［37］。另一個實驗發(fā)現(xiàn)，存在于阿爾茲海默癥患者腦脊液的外泌體磷酸化tau蛋白顯著高于正常人。隨后在1978年的一項研究進一步證實了外泌體在阿爾茲海默癥患者的神經細胞中顯著增加［37］。而這些MVB 增多的原因可能是內體攝取細胞膜表面Aβ42 的水解物，從而釋放出含有“有毒”蛋白的外泌體。外泌體作用于阿爾茲海默癥的病理機制除了使Aβ42 和磷酸化tau 蛋白擴散到正常的神經元，導致這些“有毒”蛋白的傳播，還可能因為其含有豐富的脂質，從而加速蛋白的降解。當蛋白清除通路被某種原因抑制時，外泌體便在這些“有毒”蛋白的聚集中發(fā)揮了作用。但是清除通路受損造成“有毒”蛋白的聚集，還是“有毒”蛋白的聚集導致清除通路受損卻不得而知。在神經退行性疾病中，帕金森病患病率也越來越高，帕金森病的主要病理特點是多巴胺神經元的壞死以及路易小體的出現(xiàn)，α?syn和泛素化蛋白是其主要的組成部分。α?syn不但存在于患者的腦脊液中，也存在于血液、唾液、尿液中。在帕金森病中，儲存在外泌體中的α?syn被釋放出來［37］。當這種“有毒”的蛋白擴散到其他神經元時，會導致α?syn 在正常神經細胞中聚集并沉積，當自噬系統(tǒng)無法清除這些蛋白時，神經膠質細胞會通過內吞作用，攝取并清除這些“有毒”的蛋白，但過度清除α?syn 反而會加速神經退行性改變［31］。原因可能是膠質細胞產生膠質包含物加重了炎癥反應。進一步研究表明，α?syn可以誘導小膠質細胞加速分泌外泌體［38］，而外泌體反過來可以誘導神經元中α?syn 的低聚化［31］，進一步加劇了帕金森病的發(fā)展。而在其他常見神經退行性疾病中，如在亨廷頓舞蹈癥患者的神經元和腦脊液中發(fā)現(xiàn)大量的多囊泡體，并且在這些外泌體中找到了HAP?1，這可能與自噬溶酶體系統(tǒng)受損有關。以上幾種常見的神經退行性疾病進一步論證了細胞分泌的外泌體含有的蛋白質可以作為疾病診斷的生物標志物。

5 外泌體在中樞神經系統(tǒng)中的應用

外泌體作為一種新型的藥物運輸載體具有非常多的優(yōu)勢，不但免疫性低、運輸效率高、可以穿過血腦屏障，而且可以抑制炎癥反應，可以有效、遠距離長時間運送藥物［39］。外泌體在神經系統(tǒng)疾病中治療的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾點：①通過基因工程調整外泌體的遺傳物質，從而控制外泌體所表達的物質，發(fā)揮治療作用。Alvarez?Erviti 等［40］通過給小鼠體內注射基因改造過的外泌體，實現(xiàn)了小干擾RNA（small interferin RNA，siRNA）在小鼠腦神經元中的低表達。一項來自國外的研究先使用電穿孔的方式向外泌體內注射siRNA，再通過基因工程使來源于樹突狀細胞外泌體表達與大腦神經細胞膜表面相融合的相關膜蛋白，這樣就可以通過外泌體將siRNA 準確運送到大腦神經細胞，從而實現(xiàn)了腦組織的靶向基因敲除［40］。②使用某些特殊的方法將藥物封閉或者直接轉入外泌體中，如利用脂質體轉染法或電穿孔法。研究發(fā)現(xiàn)，通過鼻內或者靜脈注射已經導入姜黃素的外泌體，這些外泌體可以通過血腦屏障迅速到達腦膠質細胞，不但能夠減少由膠質細胞導致的自身免疫性反應［41］，也能發(fā)揮抗炎作用抑制脂多糖導致的炎癥反應，從而為自身免疫性腦炎、腦脫髓鞘疾病提供新的治療方法。但是單獨注射姜黃素或者單獨注射外泌體無效。以上研究均證明了外泌體作為藥物載體對于臨床疾病治療的重要作用，為神經系統(tǒng)疾病提供了新的治療策略，但其對于人體的安全性尚需進行大量實驗來研究。

6 小 結

近年來人們對外泌體的研究飛速發(fā)展，2019年以來又有關于外泌體的最新報道［42］。在信息交流方面，無論是在生理還是病理狀態(tài)下，外泌體在細胞間的物質交換和物質運輸中均表現(xiàn)出較為明顯的優(yōu)勢。因外泌體具有高靈敏性和高特異性，且可以在體液長時間運輸，所以外泌體也逐漸被運用到分子標記上。雖然外泌體從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已有百年的歷史，但把外泌體運用到生物研究方面才剛剛開始，許多選擇機制和傳導途徑仍不明確，所以需要進一步深入研究，才能更好地將其應用于研究或臨床中。