原料奶中抗生素殘留及快速檢測方法

張彩紅 索 寶 李正洪 李兆林 陳麗娜 內(nèi)蒙古奶聯(lián)科技有限公司

引言：牛奶與人們的生活息息相關(guān)。牛奶中抗生素殘留問題受到各國政府和食品安全機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。為了保障人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全，對牛奶中抗生素殘留檢測技術(shù)的研究得到發(fā)展，并且正在尋求簡便、快速、準(zhǔn)確和敏感性高的檢測方法，以滿足日趨嚴(yán)格的殘留限量的要求?？股刈鳛閯?dòng)物藥物和飼料添加劑被廣泛應(yīng)用，必然會(huì)造成抗生素在動(dòng)物性食品內(nèi)的殘留，特別是牛奶中抗生素的殘留已引起消費(fèi)者的重視。美國、歐盟和日本等世界許多國家已經(jīng)要求對原料奶的抗生素實(shí)行強(qiáng)制性檢測，歐盟已對最大殘留量(MRL)作了詳細(xì)的規(guī)定，MRL為4μg/kg[2]。因此，只有不斷發(fā)展快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方法,才能滿足日趨嚴(yán)格的殘留限量的要求，保障牛奶的食用安全。

1 牛奶中抗生素殘留的來源

一般認(rèn)為，對泌乳牛用藥不當(dāng)或不注意休藥期是牛乳中抗生素殘留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時(shí)，易造成牛乳中抗生素的殘留。在奶牛飼料中添加飼料添加劑已十分普遍，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是預(yù)防疾病，這是牛奶抗生素殘留的重要原因。1983年，Egan調(diào)查表明，用經(jīng)抗生素治療的乳牛用過的擠乳器給正常乳牛擠乳，可使正常牛的乳中殘留抗生素，所以擠乳是乳中抗生素殘留的另一個(gè)原因[3]。此外，一些不法交奶戶在高溫季節(jié)為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，這也是乳中抗生素殘留的一個(gè)來源。

2 原料奶中抗生素殘留的危害

抗生素在畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用 ,不可避免地造成牛乳中抗生素殘留。一般的抗生素對熱的穩(wěn)定性高,牛奶加熱殺菌無法將其破壞,所以混有抗生素的牛奶加工成奶制品后仍有大量的抗生素殘留,如果經(jīng)常飲用此種牛奶,將反復(fù)受到抗生素的刺激而發(fā)生致敏。原料乳中抗生素殘留物不僅影響乳制品加工 （如嚴(yán)重干擾發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，影響干酪、黃油、發(fā)酵乳的起酵和后期風(fēng)味的形成），而且長期服用含低劑量抗生素殘留的乳制品就相當(dāng)于經(jīng)常低劑量服用抗生素，會(huì)導(dǎo)致人體耐藥性增加和免疫力下降，部分有過敏體質(zhì)的人還可能出現(xiàn)蕁麻疹、發(fā)熱甚至過敏性休克，危害人體健康[4]。完成對奶源的有效管理，這種管理概念不僅在目前中國奶源不足、飼養(yǎng)分散、管理困難情況下是最好最有效的管理模式，也是今后中國實(shí)行大規(guī)模集中飼養(yǎng)管理的必然趨勢和基礎(chǔ)。

3 原料奶中抗生素殘留的現(xiàn)狀

從全國不同城市近幾年的調(diào)查情況來看，不管是城市售鮮奶還是巴氏消毒奶，抗生素殘留奶較為嚴(yán)重。從超標(biāo)的情況看，超標(biāo)率達(dá)10%以上的藥物有10種，超標(biāo)率達(dá)20%以上的藥物有8種。牛奶中殘留的抗生素主要為青霉素類藥物和磺胺類藥物，其中CEPA和PEN-V殘留最為嚴(yán)重，檢出率達(dá)35%以上。其次是A肝、PEN-G、CIF、SD和SMZ，檢出率達(dá)20%以上。牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會(huì)的重視。我國過去對牛奶中抗生素殘留衛(wèi)生指標(biāo)無明文規(guī)定，直到2001年10月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布實(shí)施了《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，對新鮮牛乳的衛(wèi)生指標(biāo)明確了＂抗生素不得檢出＂。但對這一行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，我國目前并未能嚴(yán)格執(zhí)行，致使牛奶及奶制品中抗生素殘留問題一直未能得到解決，以至引起了人們對牛奶安全問題的擔(dān)憂，并成為越來越受關(guān)注的焦點(diǎn)。

從以上情況可以看出，我國牛奶中抗生素殘留現(xiàn)狀并不令人樂觀，有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對牛奶生產(chǎn)的管理，并對牛奶中的抗生素等藥物殘留進(jìn)行有效檢測和監(jiān)控，以保證人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全。

4 原料奶中抗生素的分類

抗生素的種類已達(dá)幾千種。在臨床上常用的抗生素有幾百種，它們主要分為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類。在發(fā)達(dá)國家牛奶中抗生素的殘留問題早就受到重視。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）早在1969年就提出了應(yīng)對各種動(dòng)物性食品中的抗生素殘留的允許標(biāo)準(zhǔn)。美國食品藥物管理局（FDA）規(guī)定牛奶中抗生素殘留量不得超過0.006國際單位/ml，超過允許量標(biāo)準(zhǔn)的牛乳及其乳制品全部做廢棄處理，其中要求A級巴氏原料奶中沒有抗生素殘留，且對原料奶的抗生素檢測為強(qiáng)制性[5]。

5 原料奶中抗生素的控制措施

目前，減少和避免原料奶中抗生素殘留應(yīng)采取以下措施：一是在獸醫(yī)的指導(dǎo)下合理用藥，不能將抗生素的使用作為預(yù)防疾病的唯一措施；二是使用合格的飼料產(chǎn)品，避免在不知情的情況下使用含有抗生素的產(chǎn)品；三是用藥后嚴(yán)格執(zhí)行停藥期；四是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，將患病奶牛單獨(dú)隔離飼喂，擠奶器具不得混用，做到安全擠奶，同時(shí)要控制牛乳腺炎的發(fā)病幾率，減少抗生素的使用[6]。

6 原料奶中抗生素的檢測方法

在奶牛生長過程中，β-內(nèi)酰胺、喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素經(jīng)常被用于治療疾病。由于各種原因，造成其在動(dòng)物的細(xì)胞、組織、器官或可食性產(chǎn)品(如蛋、奶)中的殘留，直接影響著人類的健康[7]?？股氐姆治龇椒ㄖ饕校何⑸锓ā⒚庖邔W(xué)法和高效液相色譜法。微生物法和免疫學(xué)法由于成本低和省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于篩選實(shí)驗(yàn)。高效液相色譜法主要用于確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。

（1）微生物法

微生物檢測法是應(yīng)用較廣泛的方法，其檢測原理是根據(jù)抗生素對微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用,對樣品中抗生素殘留進(jìn)行定性或定量檢測，如TTC 法（氯化三苯基四唑氮法）、BSDA法（嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法）、PD法 （紙片法）及 STOP法（拭子法）等[8]。其中，TTC 法是檢測牛奶中抗生素殘留的常用方法，也是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測方法。其檢測費(fèi)用低，但是檢測時(shí)間長，通過肉眼辨別檢測結(jié)果易產(chǎn)生誤差，且操作復(fù)雜、結(jié)果易受嗜熱鏈球菌數(shù)量和消毒劑影響和靈敏度較低。

（2）高效液相色譜法

高效液相色譜法簡單、快捷，幾乎可以檢測牛奶中所有的抗生素。2008年12月31日，我國發(fā)布了牛奶中一系列抗生素的檢測方法（GB/T 22975-2008）[9]，并于2009年5月1日正式實(shí)施，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、氯唑西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林等抗生素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)具有分離、定量和定性(分子結(jié)構(gòu)信息)等功能，靈敏性較高，特別適用于精確測定，但是其檢測程序復(fù)雜，檢測費(fèi)用高，因此一般用于大型實(shí)驗(yàn)室。

此外，隨著接口技術(shù)的顯著改進(jìn)，質(zhì)譜作為一種質(zhì)量流速型檢測器，正廣泛應(yīng)用于殘留分析的檢測中。電化學(xué)檢測器也已用于檢測鄰氯青霉素、頭孢菌素和青霉素[10]。與常規(guī)的理化分析技術(shù)相比，免疫分析技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，速度快、分析成本低。

（3）免疫分析法

目前，牧場規(guī)模擴(kuò)大，對原料奶中抗生素的檢測要求嚴(yán)格，國內(nèi)引進(jìn)了美國 CHARM 公司的先進(jìn)技術(shù)。將RIA（放射免疫檢測）技術(shù)、ELISA（酶聯(lián)合反應(yīng)）技術(shù)、生物發(fā)光技術(shù)、液體閃爍技術(shù)融為一體，推出用于快速檢測食品中抗生素殘留和黃曲霉毒素的CHARM II系統(tǒng)，使食品快速檢測方法發(fā)生重大飛躍。CHARM II是以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)，故某抗體只能特異性結(jié)合某類抗生素，即使樣品中存在其它抗生素也不會(huì)產(chǎn)生干擾，并且抗體可識(shí)別同類抗生素的共同結(jié)構(gòu)--母環(huán)，因此幾乎可以檢測β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、氨基糖苷類、新生霉素、壯觀霉素等多種抗生素以及黃曲霉毒素。CHARM II無需樣品處理，8分鐘即可得到檢測結(jié)果，并且檢測限符合歐盟、美國和中國的限量要求。

檢測原理：CHARM ROSA抗生素殘留快速檢測儀包括抗生素檢測條、孵育器和讀數(shù)儀，主要根據(jù)競爭性受體-配體免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測 （受體是細(xì)胞在進(jìn)化過程中形成的細(xì)胞蛋白組分，能識(shí)別周圍環(huán)境中某種微量化學(xué)物質(zhì)；配體是能與受體特異性結(jié)合的物質(zhì)）。檢測條具有兩條俘獲帶，其中一條為檢測帶（T，由配體組成），另一條為控制帶（C）。當(dāng)樣品與被標(biāo)記的受體混合后，受體將在俘獲帶上被俘獲，并顯出紅色,我們可以通過反應(yīng)后俘獲帶顏色的深淺來判定結(jié)果。

檢測方法：開啟孵育器電源，待溫度達(dá)到56℃時(shí)，開啟讀數(shù)儀，調(diào)整至相應(yīng)頻道，并取出待測原料奶樣品并搖勻；然后用移液器將300μL牛奶樣品豎直滴加至檢測條兩側(cè)任意一側(cè)的凹槽中，蓋上孵育器塑料蓋，8分鐘后，蜂鳴器響動(dòng)，打開塑料蓋，取出檢測條，目視或通過讀數(shù)儀判讀結(jié)果（操作步驟見圖1）。

將測試條放至加熱器凹槽，撕開試劑條的不干膠至紅色線

將樣品搖勻，用移液槍加入300μl奶樣，蓋上蓋，56℃培育8分鐘（氯霉素40℃）

將檢測條標(biāo)有＂C＂的一端插入讀數(shù)儀，按ENTER進(jìn)行檢測。目測判讀結(jié)果

β-內(nèi)酰胺四環(huán)素類檢測條：有兩條檢測線，BL線為β-內(nèi)酰胺類檢測線，TE線為四環(huán)素檢測線，若兩條檢測線中有一條或者兩條顏色均淺于質(zhì)控線，或檢測線未出現(xiàn)，則說明結(jié)果為陽性；若檢測線顏色與質(zhì)控線相當(dāng)或深于質(zhì)控線，則說明結(jié)果為陰性。

B∶Charm Rosa讀數(shù)儀判讀結(jié)果陰性質(zhì)控的結(jié)果應(yīng)為 Result：Negative，READING 小于-400。 （磺胺、鏈霉素小于-600），陽性質(zhì)控的結(jié)果應(yīng)為Result：Positive，READING 大于+400[11]。

免疫分析法是以抗原或半抗原與抗體特異性結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的生化測試技術(shù)。免疫分析法主要包括放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、熒光免疫分析法(FIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。與常規(guī)的理化分析技術(shù)相比，免疫分析技術(shù)具有操作簡單、速度快、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)。

結(jié)束語

綜上所述，鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問題，原料奶的安全問題是國內(nèi)乳品行業(yè)面臨的共同難題，其中藥物殘留，特別是抗生素殘留是原料奶中存在的安全問題之一。重視和加強(qiáng)檢測已成為工作的首要任務(wù)，并努力研究發(fā)展一些簡單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術(shù)。免疫分析法不僅是牧場生產(chǎn)中檢測抗生素的首選方法，大型的乳品生產(chǎn)企業(yè)也在廣泛使用。

[1]劉瑛，魏清芳.原料奶中抗生素殘留及危害.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）,2005年11期.

[2]曹亢,曹雪,任發(fā)政.牛奶中抗生素殘留機(jī)器檢測方法研究進(jìn)展.中國乳業(yè),2009年第09期.

[3]吳瑕,張?zhí)m威.原料奶中抗生素的來源.食品與發(fā)酵工業(yè),2004年07期.

[4]趙少華.食品(乳品)中存在抗生素殘留的風(fēng)險(xiǎn)及其控制[J].中國食品工業(yè),2008年11期.

[5]呂文東,張春華,韓秋紅，劉玲.原料奶中抗生素的分類.中國乳品工業(yè),2005年08期.

[6]劉亞男.原料奶中抗生素的防控措施.北方牧業(yè)，2011年14期.

[7]馬兆瑞,祝戰(zhàn)斌,卡爾·萊金特.乳和乳制品中殘留抗生素的檢測方法[J].中國乳品工業(yè),2003年04期.

[8]]GB/T4789.27-2008.

[9]抗生素的檢測方法（GB/T 22975-2008）.

[10]黎源倩，張禮春.超高效液相色譜同時(shí)測定奶粉和牛奶中β-內(nèi)酰胺、喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留（分析實(shí)驗(yàn)室）.

[11]卜慶倩.北京博歐實(shí)德生物技術(shù).