雷帕霉素對(duì)膿毒癥大鼠肝損害的保護(hù)作用

尹建亞 湯石林 彭登高 謝黎明 卿國(guó)忠

膿毒癥（sepsis）通常導(dǎo)致多器官功能衰竭（MODS），而肝臟損害是膿毒癥MODS的最常見表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子的過量釋放是膿毒癥誘發(fā)肝臟損害的關(guān)鍵因素[1]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（The mammalian target of rapamycin, mTOR）是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等的重要信號(hào)蛋白，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥反應(yīng)的病理生理過程中扮演重要角色[2]。Kimball等[3]發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥誘發(fā)肝損害中mTOR起著重要作用。雷帕霉素是與mTOR結(jié)合并使其失活的臨床常用免疫抑制劑，其能否減輕膿毒癥所致肝臟損害目前尚不明確[4]。本試驗(yàn)擬建立膿毒癥大鼠肝損害模型，觀察雷帕霉素對(duì)肝臟損害的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 50只Wistar雄性大鼠，購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組（10只）、膿毒癥+雷帕霉素組（20只）和膿毒癥+PBS組(20只)。雷帕霉素購(gòu)自華北制藥集團(tuán)（1mg/mL），按1mg/kg/d在實(shí)驗(yàn)前2h進(jìn)行灌胃處理。

1.2 膿毒癥模型制作 參照金惠銘的方法[5]，采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）制作膿毒癥模型。大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，常規(guī)消毒腹部，經(jīng)正中切口打開腹腔后小心分離盲腸，然后用3號(hào)絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸。結(jié)扎完畢后仔細(xì)檢查腸道通暢情況。在與腸系膜相對(duì)的盲端腸壁漿膜面用9號(hào)針頭穿刺二次（針孔間距約3mm），第一針孔距盲端約3mm。輕輕將腸道放回原處，關(guān)閉腹腔并縫合后補(bǔ)充生理鹽水（5mL/100g體重）。假手術(shù)組打開腹腔，但不進(jìn)行CLP處理。

1.3 肝臟功能生化指標(biāo)檢測(cè) 從大鼠眼眶取血約2mL，離心后予-20℃冰箱凍存，采用終點(diǎn)法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平。

1.4 炎癥因子水平的檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清TNF-α和IL-6的水平。按說明書方法，將100μL血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入板孔，蓋上封板膜后室溫孵育1h。洗板3次后加入生物素標(biāo)記TNF-α和IL-6抗體，經(jīng)過溫育、洗滌、顯色等過程后，用450nm波長(zhǎng)讀OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出TNF-α和IL-6濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素對(duì)大鼠ALT和AST水平的影響 假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)（3、6、12、24h）血清ALT和AST濃度較低。CLP術(shù)后，血清ALT和AST濃度迅速升高，ALT于24h到達(dá)高峰，AST于12h到達(dá)高峰。使用雷帕霉素處理后，血清ALT和AST水平相對(duì)于CLP+PBS組明顯降低，兩組在不同時(shí)間點(diǎn)（6、12、24h）差異存在顯著性（P<0.05)（如圖1所示）。

圖1 大鼠血清ALT和AST表達(dá)的變化（CLP+雷帕霉素vs CLP+PBS，aP＜0.05)

2.2 雷帕霉素對(duì)大鼠TNF-α和IL-6表達(dá)水平的影響 假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)（3、6、12、24h）血清TNF-α和IL-6表達(dá)水平較低。CLP術(shù)后，血清TNF-α和IL-6濃度迅速升高，于12h到達(dá)高峰。使用雷帕霉素處理后，血清TNF-α和IL-6水平相對(duì)于CLP+PBS組明顯降低，兩組在不同時(shí)間點(diǎn)（6、12、24h）差異存在顯著性（P<0.05)（如圖2所示）。

圖2 大鼠血清TNF-α和IL-6水平的變化（CLP+雷帕霉素vs CLP+PBS，aP＜0.05)

3 討論

膿毒癥主要是由感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)，炎癥因子的過度釋放在其病理生理過程中起著重要作用[6]。炎癥因子通過與其受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號(hào)途徑，直接參與對(duì)多種組織細(xì)胞的損傷過程。膿毒癥易并發(fā)MODS，肝臟損害是其主要表現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用CLP術(shù)建立了大鼠膿毒癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)ALT和AST水平明顯增高，這與其他文獻(xiàn)的報(bào)道一致[1]。主要促炎因子TNF-α和IL-6在膿毒癥并發(fā)MODS中發(fā)揮了重要的作用，我們發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后3h大鼠血清的TNF-α和IL-6水平顯著增高，提示TNF-α和IL-6可能參與了膿毒癥大鼠肝臟的損傷。

mTOR是哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,能夠整合細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)途徑，參與細(xì)胞的增殖、分化及對(duì)免疫炎癥的調(diào)節(jié)作用[7]。在膿毒癥動(dòng)物模型中，研究者發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)被激活，并參與了肝臟和骨骼肌組織中多種炎癥因子的釋放[3]。雷帕霉素通過與FKBP12組成復(fù)合物，抑制mTOR的活性[2]。在本研究中，相對(duì)于PBS組，雷帕霉素組血清ALT和AST的水平明顯降低，提示雷帕霉素對(duì)膿毒癥大鼠肝臟損害具有保護(hù)作用。雖然雷帕霉素對(duì)膿毒癥大鼠肝臟損害的保護(hù)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，但雷帕霉素下調(diào)血清TNF-α和IL-6的水平，提示抑制炎癥反應(yīng)可能是其肝臟保護(hù)的作用機(jī)制之一。張?jiān)绲萚8]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過抑制淋巴細(xì)胞增殖抑制刀豆素A誘發(fā)的肝臟損害及其炎癥反應(yīng)。Fielhaber等[9]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過抑制核因子kB（NF-kB）的激活下調(diào)肺臟炎癥因子的表達(dá)。雷帕霉素是否通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、NF-kB激活或者直接抑制mTOR活性來(lái)降低膿毒癥大鼠肝臟損害和炎癥反應(yīng)將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

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