莖瘤芥（榨菜）黑斑病菌的分離與鑒定

劉紅芳，肖龍泉，袁顯棚

（長江師范學院，重慶涪陵，408100）

莖瘤芥 （Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee）是重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，是莖瘤芥主產(chǎn)區(qū)涪陵農(nóng)民收入的主要來源。此外，在重慶市的渝北、萬州、長壽、忠縣和豐都等地區(qū)，也有較大面積種植。隨著莖瘤芥種植面積的增加，黑斑病的發(fā)生日趨嚴重，極大地影響了莖瘤芥的生產(chǎn)。引起十字花科蔬菜黑斑病的主要是半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬真菌，包括蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae）、甘藍鏈格孢（A.brassicicola）和蘿卜鏈格孢（A.japonica）3個種[1]。鏈格孢屬內(nèi)不同種之間培養(yǎng)性狀不穩(wěn)定，且高度相似和重疊，在實際操作中用傳統(tǒng)方法很難鑒定到種的水平[2]。近年來，有學者在對十字花科蔬菜黑斑病菌3個種及相近種的5.8S rDNA和其側翼ITS區(qū)進行測序的基礎上，分別設計合成了鑒定白菜黑斑病菌3個種的特異性引物[3]。為了明確莖瘤芥黑斑病的病原，為該病害防治提供理論依據(jù)，對該病害的病原物進行了分離鑒定，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病害標本采集及病害病狀觀察

莖瘤芥黑斑病標本于2011年12月分別在涪陵李渡、義和、焦石、馬武、農(nóng)科所等莖瘤芥種植區(qū)采集，并對田間病害植株進行病害癥狀觀察記錄。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

采用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養(yǎng)基（PDA）進行常規(guī)組織分離培養(yǎng)。分離到的菌株經(jīng)單孢純化后保存于PDA斜面上，置于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

采用活體接種法。在無菌環(huán)境下挑取孢子并將其接入無菌水中，制備接種液，對健康的葉片采用正背面噴霧接種，重復噴霧3次，同時對對照組噴無菌水，最后在植株葉片上套上塑料袋，室內(nèi)25℃保濕培養(yǎng)并進行觀察[4]。根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病葉片進行再分離，顯微鏡下觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

1.4 PDA培養(yǎng)基上病原菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察

將單孢分離純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃光照黑暗交替條件下培養(yǎng)7 d后，觀察菌株培養(yǎng)性狀，鏡檢孢子形態(tài)特征，測量孢子大小，根據(jù)病原菌的產(chǎn)孢表型及在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，初步鑒定到屬或種。

1.5 病原菌的PCR鑒定

基因組DNA提取采用CTAB法[5]，PCR反應條件和引物設計參考肖長昆等[3]的方法，用Abre1和Abre2、Abra1和 Abra2、Ajap1和 Ajap2這 3對特異性引物進行PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀特點

該病原菌寄生在植株葉片上，主要為害葉片，少數(shù)病斑生長在葉脈上。開始發(fā)病的時候，葉片上出現(xiàn)黑色的小斑點，隨著病斑的擴大，形狀近橢圓形或圓形，有的病斑連成一片，病斑中間部分顏色逐漸變淡，邊緣為褐色并不斷向周圍蔓延。田間病斑直徑大多在3～12 mm，發(fā)病后期病斑中央葉片組織壞死呈白色，在邊緣處可見但不十分明顯的同心紋，邊緣呈褐色（圖1）。

2.2 致病性測定

本研究采用了活體接種，結果導致健康植株發(fā)病。在活體接種發(fā)病后，從病葉上分離出病菌，發(fā)現(xiàn)其與田間發(fā)病病葉上分離出的病菌相同，由此可以證明引起莖瘤芥黑斑病的病原菌為鏈格孢屬 （Alternaria）真菌。

2.3 病原菌的培養(yǎng)特征

菌株在PDA培養(yǎng)基上，置于25℃進行恒溫培養(yǎng)，3 d后開始出現(xiàn)肉眼可見的白色菌斑；培養(yǎng)5 d后，菌斑直徑為12～13 mm，邊緣菌絲呈白色，中間顏色逐漸加深呈褐色（圖2）。25℃培養(yǎng)7 d后，菌落產(chǎn)生大量分生孢子且直徑達到23 mm左右。隨著溫度升高至30℃，菌落中間顏色變淺，邊緣仍為白色，孢子產(chǎn)量急劇減少。隨著時間增加，菌落將布滿整個培養(yǎng)皿；在厚度較薄的培養(yǎng)基中，由于缺乏營養(yǎng)，菌落生長到一定階段便停止，孢子數(shù)量增多，顏色逐漸變?yōu)槟G色。

2.4 病原菌鑒定結果

挑取培養(yǎng)7 d后的菌絲制片，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大量分生孢子梗和分生孢子。分生孢子呈黃褐色，有隔，頂端顏色較淺，孢子中間部分稍稍膨大，沒有分枝，有0～3個橫隔膜，3～9個縱隔膜。分生孢子單個著生或3～6個串生，大多形狀若蛆蟲，兩頭比中間細且顏色逐漸變淺，基部相對頂端粗而短；少數(shù)形態(tài)無明顯特征，喙無色至淺褐色，大小為（43～96）μm×（10～25）μm（圖 2）。 根據(jù)以上形態(tài)特征，參照真菌分類的相關文獻[6～8]，初步確認莖瘤芥黑斑病病原菌為半知菌亞門、鏈格孢屬（Alternaria）真菌。

圖1 莖瘤芥黑斑病田間癥狀

圖2 鏈格孢分生孢子及其菌落

2.5 分子鑒定結果

隨機挑取在5個采集點采集分離得到的單孢系中的 5 個， 其編號分別為 No.1，No.2，No.3，No.4，No.5，菌絲經(jīng)過液體振蕩培養(yǎng)，提取基因組DNA進行PCR鑒定，結果分離物均由特異引物Abre1和Abre2擴增出了371 bp的目標條帶，而甘藍鏈格孢和蘿卜鏈格孢的特異引物未擴增出條帶（圖3），說明致病病原菌是蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae。

3 小結與討論

經(jīng)過對病害癥狀特點的觀察和病葉標樣的分離、培養(yǎng)、致病性測定，以及PCR鑒定，初步確定引起莖瘤芥黑斑病的病原菌為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae。

在莖瘤芥主產(chǎn)區(qū)涪陵只發(fā)現(xiàn)蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae一種病原。其原因可能是：①采集地點過于集中，導致鑒定菌種均為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae；②李明遠[1]對秋冬白菜黑斑病研究表明，秋冬白菜黑斑病一般由蕓薹鏈格孢引起，這與同為十字花科的莖瘤芥黑斑病發(fā)病季節(jié)相吻合，其原因可能是甘藍鏈格孢與蘿卜鏈格孢在溫度較低時一般不能侵染寄主。對于莖瘤芥黑斑病是否只由蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae一個種引起，還有待進一步研究確定。

圖3 引物對Abrel-Abre2 PCR擴增Alternaria屬真菌基因組DNA結果

[1]李明遠.十字花科蔬菜黑斑病識別與防治[J].當代蔬菜，2004（10）：34-35.

[2]肖長坤，李勇，李健強.十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)大學報，2003，8（5）：61-68.

[3]肖長坤，李健強，師迎春，等.十字花科蔬菜黑斑病菌的PCR 鑒定[J].植物病理學報，2005，35（3）：278-282.

[4]方中達.植病研究方法.3版[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：193-195.

[5]Graham G C,Mayser S P,Henry R J.A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J].Biotechniques,1994,16(1):48-50.

[6]張?zhí)煊?中國真菌志:鏈格孢屬（第十六卷）[M].北京：科學出版社，1998.

[7]文朝慧，李鐵夫，王軍平，等.出口蘿卜種子中蕓薹生鏈格孢的分離與鑒定[J].植物檢疫，2007（1）：4-6.

[8]張毅，徐進，李婷，等.十字花科蔬菜黑斑病又稱黑霉病的識別與防治[J].西北園藝：蔬菜，2010（2）：43.