甘草酸二銨對人肝癌細胞SMMC－7721增殖和p53表達的影響＊

張劍鋒，李 浩，李超乾△，趙春菱，唐華民，嚴若谷

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院：1.急診科；2.研究生院，南寧530007）

甘草酸二銨（diammonium glycyrrhizinate，DG）是從中藥甘草（glycyrrhiza）中提取的一種有效活性單體化合物［1］，具有較強的抗炎、抑制肝纖維化和肝炎病毒增殖的作用［2－6］。據(jù)國內外文獻報道，長期使用復方甘草酸苷能預防肝硬化的發(fā)生，且明顯減少肝癌的發(fā)病率［7－8］，但DG對腫瘤是否具有抑制增殖作用，目前尚缺乏相關研究。本實驗擬通過體外實驗，探討DG對人肝癌細胞株SMMC－7721細胞體外增殖的抑制作用，以及其對抑癌基因p53表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞SMMC－7721購自中國科學院上海細胞庫，DG注射液購自江蘇正大天晴制藥有限公司；RIPM1640培養(yǎng)液購自Thermo Scientific公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料技術有限公司，瓊脂糖購自上海生工生物工程技術服務有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，PCR擴增引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，蛋白提取試劑購自上海碧云天生物技術研究所，鼠抗－p53單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記抗小鼠IgG購自北京中杉金橋試劑公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma scientific Inc公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠，酶聯(lián)免疫檢測儀Model－450購自美國Bio－Rad公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，Gel doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio－Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 肝癌細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入青霉素100U/mL，鏈霉素100 μg/L，置于37℃含5%CO2孵箱中培養(yǎng)。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期，常規(guī)苔盼藍計數(shù)活細胞大于95%。實驗細胞分為對照組及DG干預組，其中對照組（DG 0）未采用任何藥物干預，而DG干預組則加入DG終濃度分別為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/L進行共同孵育。

1.2.2MTT法測定細胞增殖抑制率 取處于對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化后，離心，接種于96孔板，培養(yǎng)12h，分別加入不同濃度DG，孵育48h后加入10μL MTT（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h后加入二甲基亞砜（DMSO）150微升/孔，酶標儀570nm/630nm測定吸光度值（OD值），計算細胞存活率。存活率（%）＝用藥組OD值/對照組OD值×100%。用軟件B1iss計算IC50。

1.2.3實時熒光定量PCR測定p53基因的表達

1.2.3.1引物設計與合成 從Gene Bank中查找p53及內參GAPDH基因的全長序列，采用軟件Primer5.0和oligo 6.0設計上、下游引物。p53 上游：5′－GGC CCA CTT CAC CGT ACT AA－3′，下游：5′－GTG GTT TCA AGG CCA GAT GT－3′；GAPDH 上游：5′－AAC GGA TTT GGT CGT ATT G－3′，下游：5′－CTG GAA GAT GGT GAT GGG－3′，并通過 Gene Bank進行blast比對。

1.2.3.2樣品制備 收集 DG 0.00（對照組）、2.00（低濃度組）、4.00（中濃度組）、8.00（高濃度組）mg/L處理48h后的SMMC－7721細胞，采用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，然后逆轉錄成cDNA，得到的樣品作為PCR模板。

1.2.3.3RT－PCR法檢測p53mRNA表達 RT－PCR反應體系反應條件為：95℃5min，95℃30s，59℃45s，72℃30s，共40個循環(huán)。測定樣品p53和GAPDH的Ct值，△Ct＝Ct目的基因－Ct內參基因。根據(jù)△△Ct＝△Ct干預組－△C對照組，計算

1.2.4Western blot測定p53蛋白表達 收集經(jīng)DG預處理的細胞，加入0.20mL蛋白裂解液冰上裂解30min，4℃12 000r/min離心30min，取上清液，測定蛋白樣品濃度，取60 μg總蛋白上樣，100℃5min，10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）2h，加入鼠抗人p53單克隆抗體，4℃孵育過夜，加入HRP標記抗鼠IgG，同時加入HRP標記鼠抗GAPDH的單克隆抗體作為內參。室溫孵育1h，暗房進行壓片、顯影、定影，底片經(jīng)LEICA Q2550IW圖像處理系統(tǒng)分析，測定各條帶的光密度值，進行定量分析［9］。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)用s表示，運用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結 果

2.1DG對SMMC－7721細胞增殖的影響 DG對SMMC－772l細胞具有明顯的增殖抑制作用。DG呈濃度依賴性降低細胞的存活率（圖1）。DG劑量為4.00、8.00、16.00mg/L時其抑制率分別為44.52%、66.78%、91.24%。倒置顯微鏡下觀察，與對照組比較，DG作用后，細胞形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，細胞質內出現(xiàn)空泡，大部分細胞貼壁不良，細胞膜出現(xiàn)皺縮、細胞變圓、脫落凋亡，且此現(xiàn)象隨著DG濃度增大而更為明顯，DG 0、2.0、4.0、8.0mg/L作用細胞48h顯微鏡觀察圖片見圖2。DG作用SMMC－772l細胞48h的IC50值為（4.31±0.21）mg/L。

圖1 DG對SMMC－7721細胞增殖的抑制作用

2.2p53mRNA表達水平的變化 DG 2.00、4.00、8.00mg/L預處理48h后，p53mRNA表達明顯上調，分別為2.12±0.186、2.56±0.102、2.68±0.211，與對照組（1.08±0.211）比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3p53蛋白表達的變化 與對照組比較，DG （2.00、4.00、8.00mg/L）預處理SMMC－7721細胞48h后，p53蛋白表達明顯提高，見圖3。

圖2 各組SMMC－7721細胞顯微鏡觀察圖像（10×10）

圖3 Western blot檢測p53蛋白表達

3 討 論

肝癌為世界上惡性程度極高的惡性腫瘤之一，其預后極差。每年全球約有125萬人患病，而在我國肝癌處于惡性腫瘤病死率的第2位，廣西尤其為肝癌高發(fā)地區(qū)，對人民群眾健康造成極大威脅。近年來，肝癌的病因學研究已取得很大進展，認為肝癌的發(fā)生是在遺傳易感性的基礎上，各種環(huán)境致癌因子的作用，以致體細胞多種原癌基因激活及抑癌基因的失活，最終導致細胞生長、增殖、分化發(fā)生紊亂的結果［10］。如能尋找有效藥物抑制原癌基因激活或者抑癌基因的失活，則可能對肝癌的治療效果有顯著提高。

DG是從中藥甘草中提取的一種有效成分，現(xiàn)代研究表明，DG具有抗炎，抗病毒（肝炎病毒、艾滋病病毒等），防治腫瘤和保護肝細胞等多方面作用［11－13］，臨床應用廣泛。但其對肝癌細胞增殖是否有抑制作用，目前未見相關報道。本實驗采用不同濃度的DG作用于肝癌細胞SMMC－7721，MTT法測定結果顯示細胞生長受到明顯的抑制，作用細胞48h后的IC50值為（4.31±0.21）mg/L，表明DG具有較強抑制腫瘤細胞增殖作用，且這種抑制作用具有濃度依賴性。

為了進一步闡明DG抑制肝癌細胞增殖的作用機制，本實驗選取了與肝癌發(fā)生過程有著密切聯(lián)系的p53基因進行分子水平研究。p53基因與腫瘤發(fā)生有很高的相關性［14］。本研究結果顯示，DG上調了p53基因及其蛋白的表達，但其具體調節(jié)機制尚未明確。p53是細胞凋亡反應和細胞周期調控的重要因子，在人類多種腫瘤中均具有較高的突變率，將p53用于腫瘤基因治療可能具有潛在應用價值。不少證據(jù)表明p53與肝癌發(fā)生的過程有著密切的聯(lián)系［15－16］。本研究小組將對DG調控p53的具體調節(jié)機制進一步研究，下一步將建立肝癌在體動物模型，以證實DG對肝癌作用的特異性與有效性，以期盡早明確DG對肝癌的可能治療作用及其機制。

綜上所述，DG能明顯抑制肝癌細胞的過度增殖，其可能通過上調p53基因和蛋白表達，加速細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞惡性增殖的效果，但其對p53的具體調控機制尚待進一步研究明確。

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