6種植物乙醇提取物對金銀花尺蠖的生物活性1)

向玉勇 何 斌 王精山

(滁州學院，滁州，239012)

金銀花尺蠖(Heterolocha jinyinhuaphaga Chu)是近年來新發(fā)現(xiàn)的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東等地已有報道［1－3］。該蟲為鱗翅目尺蛾科昆蟲，別名拱腰蟲，在安徽省1年發(fā)生3代［4］，常將葉片咬成缺刻或孔洞，危害嚴重的地塊金銀花葉片被全部吃光，僅剩葉脈和葉柄，常造成金銀花的大面積減產(chǎn)，甚至成片死亡，給金銀花生產(chǎn)帶來嚴重損失。目前，國內(nèi)對金銀花尺蠖的防治手段主要是以化學防治為主［2－3］，［5］，但長期不合理使用某些有機合成農(nóng)藥，不僅殺傷天敵、使害蟲的抗藥性增強，而且還加重了金銀花中農(nóng)藥殘留，降低藥材品質。因此，必需尋找新的高效、低毒、低殘留、對環(huán)境安全的藥劑來治理，以提高金銀花的價值，保護人們身體健康。

從植物中提取高效低毒活性成分用于防治害蟲，近年來已成為害蟲生物防治領域的一個研究熱點。迄今為止，人們已發(fā)現(xiàn)不少植物中含有對害蟲具有很高殺蟲活性的物質［6－8］，它具有選擇性強、作用方式獨特、對害蟲天敵和人畜毒性低、與環(huán)境和諧度高、在自然環(huán)境下易分解以及害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點，因此，具有廣闊的應用前景。目前，國內(nèi)有許多學者研究了植物提取液對多種害蟲的生物活性［9－13］，但尚未見植物提取液對金銀花尺蠖生物活性研究的報道。本研究以大蒜(Allium sativum L.)、側柏(Platycladus orientalis(Linn.)Franco)、夾竹桃(Nerium oleander Linn.)、銀杏(Ginkgo biloba Linn.)、樟樹(Cinnamomum camphora(L.)Presl)和石蒜(Lycoris radiata(L'Her.)Herb.))6 種植物的乙醇提取物為試驗材料，研究其對金銀花尺蠖幼蟲的生物活性，以期篩選出一些對金銀花尺蠖幼蟲有較好作用效果的植物提取物，從而為深入研究有效殺蟲成分、作用機理以及開發(fā)利用作為防治金銀花尺蠖的植物源殺蟲劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲的飼養(yǎng)

從滁州市郊三界鎮(zhèn)野生金銀花上采集金銀花尺蠖幼蟲，在人工氣候箱(RXZ－288A型，寧波江南儀器制造廠)中飼養(yǎng)多代。人工氣候箱光周期為14 h光照/10 h黑暗、溫度為(25±1)℃、相對濕度為(70±7)%。采摘新鮮的金銀花葉片，洗凈、擦干后放入600 mL的罐頭瓶內(nèi)飼養(yǎng)幼蟲，每瓶放10頭幼蟲，每天換新鮮葉片。待其化蛹后，用濕潤紗布鋪于瓶底，每天定期檢查羽化情況，把同日羽化的雌雄成蟲配對后放于同一養(yǎng)蟲籠內(nèi)，用10%的蔗糖水補充營養(yǎng)，讓其交配產(chǎn)卵。

1.2 供試植物

6種供試植物的采集地點及取材部位見表1。

表1 供試植物種類

1.3 試驗器材

化學試劑:95%乙醇(上海實意化學試劑有限公司);丙酮(上海實意化學試劑有限公司)，均為分析純級。

儀器:旋轉蒸發(fā)器(RE－52AA型，上海亞榮生化儀器廠);精密烘箱(20011243型，西班牙Selecta公司);高速萬能粉碎機(FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司);循環(huán)水式多用真空泵(SHB－III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司);電子天平(CP224S型，西班牙賽多利斯公司)，10 μL微量進樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)。

1.4 研究方法

植物乙醇提取物的制備:將采集回來的植物材料用清水洗凈、陰干后置于恒溫干燥箱中45℃烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過40目篩，制成干粉。稱取10 g干物質，置于棕色廣口瓶中，加入100 mL 95%乙醇浸泡3 d后，過濾，濾渣再用100 mL 95%乙醇浸泡2 d，過濾，濾渣再浸泡1 d后過濾。合并3次的濾液，經(jīng)旋轉蒸發(fā)器蒸發(fā)，制成膏狀物質，稱質量后用丙酮定溶成50 mL，此時質量濃度為0.2 g/mL，在冰箱中4℃避光保存。

非選擇性拒食活性測定:采用葉碟法。把6種植物提取物用丙酮稀釋成20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 g/L 5 個不同的質量濃度梯度，用打孔器將新鮮的金銀花葉片打成小葉碟(D=15 mm)，分別放入到各種不同質量濃度植物提取物內(nèi)浸泡5 s取出，在室內(nèi)晾干后放入直徑12 cm的培養(yǎng)皿中(內(nèi)墊濾紙，并加少量蒸餾水保濕)，每個培養(yǎng)皿中對稱擺入數(shù)目相同的各處理葉碟，接入饑餓12 h的金銀花尺蠖3齡幼蟲1頭，培養(yǎng)皿口覆上保鮮膜，并用昆蟲針扎許多小孔，20頭蟲為一處理，每處理重復3次，另用丙酮作對照。然后把培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中，于12、24、36、48、72 h 后用方格紙測定其取食面積，按以下公式計算拒食率:拒食率=(對照組取食面積 －處理組取食面積/對照組取食面積)×100%。

觸殺作用測定:采用微量點滴法。在預先觸殺試驗的基礎上，把6種植物提取物用丙酮稀釋成20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 g/L 5 個梯度。選取大小一致的金銀花尺蠖3齡幼蟲作為試蟲，用微量進樣器吸取1 μL的各質量濃度的植物提取物點滴在蟲體的前胸背板上，每種質量濃度提取物點滴25頭幼蟲，重復3次，另用丙酮作對照。將處理后的幼蟲移入一次性朔料杯子中，飼喂新鮮的金銀花葉片，杯口覆上保鮮膜，并用昆蟲針扎許多小孔，然后置于人工氣候箱中，于12、24、36、48、72 h 后統(tǒng)計死亡蟲數(shù)(用毛筆輕觸幼蟲，不能爬行或蟲體翻轉均視為死亡)，計算死亡率和校正死亡率。求出72 h后的毒力回歸方程及LC50、LC50的95%置信區(qū)間等。

死亡率=(死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù))×100%。

校正死亡率=(處理死亡率－對照死亡率)/(100－對照死亡率)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 11.5進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 植物提取物對金銀花尺蠖的非選擇性拒食活性

從表2中可以看出，大蒜、側柏、夾竹桃、銀杏、樟樹和石蒜6種植物提取物對金銀花尺蠖均表現(xiàn)出一定的拒食活性。方差分析表明，6種植物提取物的不同質量濃度對金銀花尺蠖的拒食活性有顯著差異。在20g/L時的平均拒食率最高，分別為77.87%、68.48%、60.80%、63.17%、72.23%和 65.90%。

表2 6種植物提取物對金銀花尺蠖的非選擇性拒食活性

隨著提取物質量濃度的降低，對金銀花尺蠖的拒食率逐漸降低;6種植物提取物不同作用時間的P值均小于0.05，說明6種植物提取物的不同作用時間對金銀花尺蠖的拒食率也有顯著差異，12 h的平均拒食率最高，分別為75.60%、66.52%、58.14%、61.35%、70.98% 和 63.93%，隨著作用時間的延長，各提取物的拒食率也逐漸下降。各種植物提取物的質量濃度和作用時間交互作用對金銀花尺蠖的拒食率無顯著影響。6種植物提取物對金銀花尺蠖的平均拒食率(ˉX)分別為65.28%、55.46%、46.86%、50.11%、60.08% 和 52.75%。方差分析表明，6種植物提取物對金銀花尺蠖的拒食活性無顯著差異(P ＜0.05)。

2.2 植物提取物對金銀花尺蠖的觸殺作用

從表3中可以看出，大蒜、側柏、夾竹桃、銀杏、樟樹和石蒜6種植物提取物對金銀花尺蠖均表現(xiàn)出一定的觸殺作用。

表3 6種植物提取物對金銀花尺蠖的觸殺作用

方差分析表明，6種植物提取物的不同質量濃度對金銀花尺蠖的觸殺作用有顯著差異。在20 g/L時的平均觸殺作用最強，校正死亡率分別為30.39% 、23.68% 、53.85% 、47.21% 、37.07% 和49.72%，隨著提取物濃度的降低，校正死亡率逐漸降低;6種植物提取物的不同作用時間對金銀花尺蠖的觸殺作用也有顯著差異，72 h的平均觸殺作用最強，校正死亡率分別為 36.16%、28.79%、61.40%、52.74%、40.51% 和 56.64%;各種植物提取物的質量濃度和作用時間交互作用對金銀花尺蠖的觸殺活性無顯著影響。方差分析還表明:6種植物提取物對金銀花尺蠖的觸殺作用有顯著差異(P＜0.05)。其中，夾竹桃的觸殺作用最強，校正死亡率為44.26%，側柏的觸殺作用最弱，校正死亡率為17.54%。

2.3 植物提取物對金銀花尺蠖的毒力測定

從表4中可以看出，處理72 h后大蒜、側柏、夾竹桃、銀杏、樟樹和石蒜提取物的LC50分別為22.741 3、34.382 5、0.495 6、2.440 7、10.361 2、1.080 3 g/L?？梢姡瑠A竹桃提取物對金銀花尺蠖的毒力最強，其次是石蒜和銀杏，大蒜和樟樹提取物的毒力相對較弱，側柏提取物的毒力最弱。

表4 不同植物提取物對金銀花尺蠖的毒力測定

3 結論與討論

金銀花尺蠖是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害金銀花的重要害蟲，為了及時控制其危害，國內(nèi)的科研工作者開展了一定的防控措施研究［2－3］，［5］，但大多數(shù)都只局限于化學藥劑的防治方面，而金銀花是中藥材原料，不能施用劇毒的化學藥劑。從植物中探尋低毒、高效的殺蟲物質，已成為新殺蟲劑研究開發(fā)的大趨勢，國內(nèi)外學者已經(jīng)在這方面做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)很多植物中都存在有殺蟲活性的物質［14－16］。安徽地處中緯度地帶，屬暖溫帶向亞熱帶的過渡型氣候，植物資源相對豐富，有毒或有害植物種類較多，但在植物提取物殺蟲活性方面研究的比較少。筆者對大蒜、側柏、夾竹桃、銀杏、樟樹和石蒜6種植物乙醇提取物進行研究，發(fā)現(xiàn)這6種植物提取物對金銀花尺蠖均表現(xiàn)出一定的拒食活性和毒殺作用，但各種植物提取物的拒食作用差異不顯著，隨著提取物質量濃度的降低和作用時間的延長，對金銀花尺蠖的拒食率逐漸降低;各種植物提取物的觸殺作用差異顯著，其中，夾竹桃提取物的觸殺效果最好，校正死亡率高達44.26%，顯著高于其他植物提取物，毒力分析也表明，夾竹桃提取物對金銀花尺蠖的毒力最強，處理72 h 的 LC50為0.495 6 g/L。

本研究只是對6種供試植物粗提物的生物活性進行了測定，認為供試的6種植物中均存在一定的活性物質，這些活性物質對防治金銀花尺蠖可以起到一定作用。但植物的不同部位含有不同的化學成分或是不同濃度的化學成分，以及采用不同溶劑和不同提取方法都會導致對試蟲的生物活性不同［17－19］，今后還需要進行植物不同部位和不同提取工藝的比較試驗，進一步對這些活性物進行分離純化、深入研究其有效成分的作用機理、進行田間藥效試驗，為利用植物源活性物質開發(fā)成植物源殺蟲劑防治金銀花尺蠖提供新的思路。

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