萱草花莖離體培養(yǎng)與快速繁殖

畢曉穎 王 寧

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽，110161)

萱草(Hemerocallis spp.)是百合科萱草屬的多年生草本花卉，其花型優(yōu)美、花色豐富、葉叢美觀，適應(yīng)廣泛的土壤和氣候條件，是世界上最重要的宿根花卉之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。近年來，隨著生態(tài)節(jié)約型園林理念的倡導(dǎo)，宿根花卉越來越受重視，人們對(duì)萱草新品種的需求也越來越大。但目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的萱草品種大多引自國(guó)外［3－4］，價(jià)格昂貴，種源有限，且種苗生產(chǎn)以傳統(tǒng)分株繁殖為主，繁殖系數(shù)低，因此，很難在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，嚴(yán)重地限制了其在園林中的廣泛應(yīng)用。

離體再生培養(yǎng)是植物大規(guī)模微體繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化研究的技術(shù)保障［5－6］。目前已報(bào)道了萱草通過花莖［7－10］、葉片［11］、原生質(zhì)體［12］等途徑再生完整植株，但研究主要集中在‘金娃娃’等少數(shù)品種上，而且不同品種的結(jié)果不盡相同［13－15］。基因型是影響植物再生體系建立的關(guān)鍵因素之一。萱草遺傳背景復(fù)雜，品種資源豐富，截止2009年，僅在美國(guó)萱草協(xié)會(huì)登錄的品種就達(dá)64 329個(gè)。因此，不同品種間基因型的差異可能是影響萱草植株再生的首要因素。培養(yǎng)基中激素種類及質(zhì)量濃度也是影響植株再生的重要因素之一。本研究以17個(gè)優(yōu)良萱草品種為試材，建立萱草花莖離體再生體系，探討基因型及激素對(duì)萱草花莖離體再生植株的影響，為不同基因型萱草再生體系的建立和試管苗的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2009年6月—2011年6月份在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院組織培養(yǎng)室進(jìn)行。供試17個(gè)萱草品種分別為‘金娃娃’(‘Stella De Oro’)、‘波旁之王’(‘Bourbon King’)、‘小酒杯’(‘Little Wine Cup’)、‘摩洛哥紅’(‘Marocco Red’)、‘波久’(‘Pojo’)、‘秋紅’(‘Autumn Red’)、‘杜 威’(‘Dewey Roquemore’)、‘走好運(yùn)’(‘Bonanza’)、‘重瓣魏河’(‘Double River Wye’)、‘紫泉’(‘Purple Waters’)、‘層雪’(‘Ortic Snow’)、‘小野蜂’(‘Little Bumble Bee’)、‘盛夏紅酒’(‘Summer Wine’)、‘海爾范’(‘Frans Hals’)、‘喜歸來’(‘Happy Returns’)、‘娃娃 語’(‘Siloam Baby Talk’)、橙花’(‘Orange’)，試材均取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地，選用幼嫩花莖為外植體。

材料用流水沖洗20 min，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用70%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2浸泡8 min，然后用無菌水沖洗3～5次，置于三角瓶中備用。

初代培養(yǎng):將‘金娃娃’萱草花莖外植體接種到附加不同質(zhì)量濃度的6－BA、NAA、IBA的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理9瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次。用于篩選誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽分化的最佳培養(yǎng)基。在 MS+6 －BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培養(yǎng)基上，接種花莖分枝處以上部分和分枝處以下部分，每個(gè)部位接種5瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次，比較花莖不同部位離體培養(yǎng)再生效果。

將不同基因型萱草花莖分枝處以上部分接種在MS+6 － BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶2個(gè)外植體，重復(fù)3次。4周時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率。愈傷組織誘導(dǎo)率=(形成愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%，不定芽分化率=(分化不定芽外植體數(shù)/形成愈傷組織外植體數(shù))×100%。

繼代增殖培養(yǎng):將金娃娃初代培養(yǎng)的芽叢轉(zhuǎn)移到附加不同質(zhì)量濃度的6－BA、NAA、IBA的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種9瓶，重復(fù)3次。用于篩選繼代增殖培養(yǎng)最適合的培養(yǎng)基。

在 MS+6 －BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1培養(yǎng)基上分別接種不同基因型初代培養(yǎng)的芽叢，每個(gè)處理接種9瓶，重復(fù)3次。繼代培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=不定芽增殖總數(shù)/接種不定芽數(shù)。

生根培養(yǎng):將生長(zhǎng)健壯，高5 cm左右的試管苗轉(zhuǎn)接到1/2MS附加不同質(zhì)量濃度NAA和IBA的生根培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次。15 d后調(diào)查生根率、生根條數(shù)及根長(zhǎng)度。生根率=(生根的無根苗個(gè)數(shù)/接種的無根苗總個(gè)數(shù))×100%。

煉苗移栽:當(dāng)試管苗根長(zhǎng)1.5 cm左右時(shí)，將三角瓶封口膜逐漸打開，煉苗3 d后移栽到河沙中。20 d后調(diào)查移栽成活率。成活率=(成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù))×100%。

培養(yǎng)條件:以MS為基本培養(yǎng)基，附加3.0%蔗糖、5.0 g·L－1瓊脂，pH=5.8，培養(yǎng)溫度(25 ±2)℃，光照強(qiáng)度20 ～30 μmol·m－2·s－1，光照時(shí)間 12 h·d－1。

應(yīng)用DPS7.05統(tǒng)計(jì)軟件中完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素統(tǒng)計(jì)鄧肯氏新復(fù)極差顯著性分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)花莖愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響

接種數(shù)天后，外植體均有不同程度膨大和翻卷，15 d后開始有愈傷組織產(chǎn)生并逐漸分化出不定芽。附加IBA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織濃綠色、致密，附加NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織黃白色、疏松。由表1可知，NAA比IBA更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，當(dāng)6－BA的質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1，NAA 的質(zhì)量濃度為 0.05 mg·L－1或 0.10 mg·L－1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽的分化率最高，分別為 67.9%和 80.0%、70.4% 和 84.2%，差異不顯著，但NAA的質(zhì)量濃度為0.10 mg·L－1時(shí)分化出的不定芽數(shù)量更多，質(zhì)量更好(圖1A)。因此，初代培養(yǎng)最適合的培養(yǎng)基為 MS+6－BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)‘金娃娃’萱草花莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響

2.2 花莖不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響

由表2可知，花莖不同部位外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率差異顯著，花莖分枝處以上部分的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率分別為84.4%和92.1%，分枝處以下部分僅為37.8%和64.4%。由此可見，花莖分枝處以上部分是愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的最佳外植體部位。研究中還發(fā)現(xiàn)，花莖分枝處以上部分除了切口處產(chǎn)生愈傷組織外(圖1B)，分枝處也能產(chǎn)生愈傷組織并分化出不定芽(圖1C)。

表2 ‘金娃娃’萱草花莖不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響

2.3 不同基因型花莖愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的差異

在 MS+6 －BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1培養(yǎng)基上，16個(gè)萱草品種的花莖外植體接種10～15 d后均可以產(chǎn)生愈傷組織，但不同品種的愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著，愈傷組織的顏色、質(zhì)地和生長(zhǎng)速度也有所不同。如表3所示，‘秋紅’、‘波旁之王’和‘海爾范’的愈傷組織誘導(dǎo)率均在50%以上;‘重瓣魏河’和‘娃娃語’的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為6.7%。外植體接種20～30 d，愈傷組織不斷膨大，表面形成突起并且陸續(xù)分化出不定芽，其中‘波旁之王’、‘波久’、‘秋紅’、‘海爾范’的不定芽分化率均在80%以上;‘杜威’和‘盛夏紅酒’不定芽的分化率最低，只有16.7%和25.0%。不同基因型的不定芽質(zhì)量和數(shù)量差別比較大，‘波旁之王’和‘小酒杯’每塊愈傷組織分化的不定芽數(shù)均在10株以上(圖1D、圖1E)，‘摩洛哥紅’每塊愈傷組織僅可以分化出2～3株不定芽(圖1F)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，‘波旁之王’、‘波久’、‘秋紅’、‘海爾范’等品種80%以上的愈傷組織是在花梗分枝處產(chǎn)生的，并且很容易分化出不定芽。

圖1 萱草離體培養(yǎng)快速繁殖過程

表3 不同基因型萱草花莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的差異

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)試管苗增殖的影響

由表4可知，不同培養(yǎng)基的試管苗增殖系數(shù)差異顯著，添加NAA的培養(yǎng)基顯著高于添加IBA的培養(yǎng)基。其中，MS+6 －BA2.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，為 5.5，但在添加NAA的培養(yǎng)基上，芽苗主要通過愈傷組織分化出不定芽的方式增殖，這類不定芽的整齊度和成活率較低，特別是多次繼代培養(yǎng)后，誘導(dǎo)出的乳白色愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，雖然能保持一定的分化率，但是成苗率逐漸降低。而在添加IBA的培養(yǎng)基上，芽叢的基部可以直接形成不定芽，這類不定芽健壯、整齊、生長(zhǎng)迅速，其中MS+6－BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1的增殖系數(shù)為 4.7(圖1G)。綜合考慮，繼代增殖最適合的培養(yǎng)基為MS+6 － BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)‘金娃娃’萱草試管苗增殖的影響

2.5 不同基因型萱草試管苗增殖的差異

由表5可知，不同品種的試管苗增殖系數(shù)差異顯著，試管苗的生長(zhǎng)狀況也有差異，‘海爾范’的增殖系數(shù)最高，為5.2，試管苗葉色淺綠，長(zhǎng)勢(shì)較好(圖1H);‘秋紅’的試管苗葉色濃綠，植株健壯;‘紫泉’的增殖系數(shù)雖然較高，但是部分植株呈現(xiàn)玻璃化;‘波久’增殖系數(shù)最低，為1.5，大部分植株葉片卷曲，長(zhǎng)勢(shì)較差(圖1G)。

表5 不同基因型萱草試管苗增殖的差異

2.6 不同激素種類及質(zhì)量濃度對(duì)試管苗生根的影響

萱草生根較為容易，但在不同培養(yǎng)基中的生根率、根數(shù)及根長(zhǎng)度差異顯著。在附加IBA的培養(yǎng)基中，試管苗生根迅速，根黃白色、細(xì)長(zhǎng)柔軟，不易折斷，組培苗較高且健壯;由表6可知，IBA質(zhì)量濃度為3.0 mg·L－1時(shí)，試管苗生根率最高，為 93.3%，平均生根條數(shù)4.2條(圖1J)。在附加NAA的培養(yǎng)基中，試管苗基部有愈傷組織，生根緩慢，根白色，粗且脆，NAA質(zhì)量濃度為0.10 mg·L－1時(shí)，生根率最高，為82.2%，平均根數(shù)為3.0條。因此，最適合的生根培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA3.0 mg·L－1。

2.7 煉苗與移栽

使用河沙作為基質(zhì)，試管苗移栽5 d后葉片變濃綠，移栽10 d后根系明顯伸長(zhǎng)，并長(zhǎng)出大量的側(cè)根，植株生長(zhǎng)健壯(圖1K)，移栽成活率達(dá)98%以上。待小苗發(fā)新葉即可上盆移栽(圖1L)。

表6 不同激素種類及質(zhì)量濃度對(duì)萱草試管苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

很多萱草組織培養(yǎng)研究都采用花莖為外植體［16－18］，與莖尖或根等為外植體相比，花莖用作初代培養(yǎng)的外植體具有取材方便、材料豐富、易消毒、不損傷母本植株、能保存母本品種優(yōu)良性狀、不定芽誘導(dǎo)率高等優(yōu)點(diǎn)。但萱草為圓錐花序，花莖較長(zhǎng)且存在分枝，具體是哪部分起作用不甚明了。文中的研究結(jié)果表明，其中起關(guān)鍵作用的是幼嫩花莖分枝以上部分，這與蘭麗婷［7］、倪新［19］和 Chen Jianxin［20］的研究結(jié)果一致，這樣在外植體的選擇上就更有準(zhǔn)確性。

本研究發(fā)現(xiàn)，‘金娃娃’花莖外植體在不同激素種類及質(zhì)量濃度配比的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率差異顯著，說明激素是影響萱草花莖離體再生的重要因素。將17個(gè)萱草品種的花莖分枝處以上部分作為外植體，接種在相同的培養(yǎng)基上，其愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化能力表現(xiàn)出顯著差異，其中‘金娃娃’最高，其次是‘波旁之王’、‘秋紅’和‘海爾范’，‘重瓣魏河’和‘娃娃語’最低。可見，基因型也是影響萱草離體再生的重要因素之一，這與倪新［19］和宋雪蓮等［21］的研究結(jié)果相同。因此，今后應(yīng)針對(duì)不同萱草品種進(jìn)行系統(tǒng)的組織培養(yǎng)研究。

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