六味降抗合劑的制備與臨床應(yīng)用

于東平，張軍紅，孫 建

六味降抗合劑是山東省食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)生產(chǎn)的醫(yī)院制劑(魯藥制字Z07080052)，由茵陳、黃芩、大黃、益母草、白芍、木香6味藥物組方，具有清熱解毒、利濕退黃、調(diào)和氣血的作用，用于既往有流產(chǎn)、死胎或新生兒溶血癥的患者此次妊娠母兒血型不合者，血清血型抗體滴度大于1∶64，且有新生兒溶血癥可能的孕婦，療效較好?，F(xiàn)將制備方法、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用報道如下。

1 儀器與試藥

三用紫外分析儀(上?？等A生化儀器制造廠);PHS－3F型數(shù)字顯示式酸度計(上海電子光學(xué)技術(shù)研究所);TG－328A型分析天平(上海長江科學(xué)儀器廠);Waters486型高效液相色譜儀(美國Waters公司)。六味降抗合劑(本院制劑科自制);黃芩苷對照品、綠原酸對照品、去氫木香內(nèi)脂對照品、木香烴內(nèi)脂對照品、芍藥苷對照品、大黃對照藥材 (中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110715－200514，110753－200413，111525－200505，111524－200503，110736－200629，120984);其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與制備

處方:茵陳 84 g，黃芩84 g，大黃61 g，益母草 169 g，白芍68 g，木香34 g，制成1 000 mL。

制備:以上6味藥，加水浸泡1h，煎煮3次，每次1h，合并煎液，靜置24 h，取上清液濃縮至近1 000 mL，過濾，加水至1 000 mL，灌裝，滅菌，即得。

2.2 質(zhì)量控制

2.2.1 性狀

本品為深棕色液體，味微苦，微有沉淀。

2.2.2 TLC 鑒別

益母草[1]:取本品30 mL蒸至稠膏，加80%乙醇50 mL，加熱回流30 min，濾過。取濾液20 mL，蒸至稠膏，殘渣加1%鹽酸溶液5 mL使溶解，濾過。取濾液分置于3支試管中，每支1 mL，一支加碘化鉍鉀試液1～2滴，產(chǎn)生橙紅色沉淀;一支加碘化汞鉀試液1～2滴，產(chǎn)生黃白色沉淀;另一支加硅鎢酸試液1～2滴，產(chǎn)生灰白色沉淀。取濾液1 mL，加醋酸鉛試液2～3滴，即產(chǎn)生桔黃色沉淀;另取濾液1 mL，加鎂粉少量與鹽酸3～4滴，顯紅色。

黃芩[1，3]:取本品1 mL，加75%乙醇溶液5 mL，搖勻，作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加75%乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方除去黃芩制成陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2]試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水(10∶7∶5∶3)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1 A。

茵陳[1]:取本品20 mL，加枸椽酸調(diào)pH至3.0以下，用醋酸乙酯萃取4次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方除去茵陳制成陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2]試驗，吸取上述2種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯－甲酸－水(10∶2∶1)為展開劑，展開，展距為8～9 cm，取出，晾干，在紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1 B。

大黃[2，3]:取本品 20 mL，加鹽酸 2 mL，置水浴上加熱 30 min，放冷，用乙醚振搖提取兩次，每次20 mL，合并乙醚液蒸干，殘渣加氯仿2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。按處方除去大黃制成陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2]試驗，吸取上述兩種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個橙黃色熒光斑點(diǎn);置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

木香[2]:取本品5 mL，加三氯甲烷10 mL，超聲處理30 min，取三氯甲烷層，作為供試品溶液。另取去氫木香內(nèi)脂對照品、木香烴內(nèi)脂對照品，分別加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg溶液，作為對照品溶液。按處方除去木香制成陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－環(huán)己烷(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1 D。

白芍[2－3]:取本品 5 mL，加乙醇 10 mL，振搖 5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。按處方除去白芍制成陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2]試驗，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40 ∶5 ∶10 ∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。見圖1 E。

2.2.3 檢查

相對密度:應(yīng)為 1.02～1.12[2]。

pH:應(yīng)為 4.5 ～6.0[2]。

其他:應(yīng)符合《中國藥典(一部)》附錄合劑項下的各項規(guī)定[2]。

2.2.4 含量測定

照高效液相色譜法[2]測定。色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗:色譜柱 C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)柱;流動相:甲醇－水－磷酸(47 ∶53 ∶0.2);流 速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:280 nm。按色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各5μL進(jìn)樣檢測。結(jié)果黃芩苷色譜峰峰形對稱，與基線分離，陰性對照品溶液對黃芩苷色譜峰無干擾。高效液相色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

對照品溶液的制備:精密稱取黃芩苷對照品6 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，水浴中振搖使其溶解，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，吸取上述溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每1 mL含黃芩苷0.06 mg)。

供試品溶液的制備:精密量取本品10 mL，烘干，加70%乙醇40 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌殘渣和容器，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

陰性對照品溶液的制備:取處方中除黃芩外的其他藥材，按制劑工藝制備，按供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液。

線性關(guān)系考察:分別精密量取黃芩苷對照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL，進(jìn)樣檢測。記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐峰，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=233 437.8X－27 943.84，r=0.999 9，結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在 0.12 ～0.60 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

精密度試驗:精密吸取黃芩苷對照品溶液，進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣5μL，測得色譜峰面積 RSD為0.5%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取供試品溶液，分別于 0，2，4，6，12，24 h時進(jìn)樣10μL，測得峰面積的 RSD為0.5%，說明黃芩苷在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取供試品5份(批號為090107)，分別制備供試品溶液，測定峰面積，結(jié)果黃芩苷的 RSD為1.02。說明本辦法重復(fù)性良好。

回收率試驗:取已知黃芩苷含量的供試品6份(批號為090107，黃芩苷含量為 0.102 5 g/L)，各精密量取 1 mL，烘干，再分別精密加入一定量的黃芩苷對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備加樣回收供試品溶液，分次精密吸取5μL，進(jìn)樣檢測。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

樣品含量測定:精密量取3批樣品各10 mL，按供試品溶液的制備方法制得，精密吸取5μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件檢測。記錄峰面積，由回歸方程計算黃芩苷的含量(本品黃芩苷含量不得低于 0.075 6 g/L)，結(jié)果見表 2。

表2 黃芩苷樣品含量測定結(jié)果

2.3 臨床應(yīng)用

2.3.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1)孕婦既往有流產(chǎn)、死胎及新生兒溶血癥分娩史，此次妊娠母兒血型不合者。2)夫婦Rh血型不合，孕婦為Rh陰性，丈夫為Rh陽性。3)孕婦血清免疫學(xué)檢查符合下列標(biāo)準(zhǔn):部分中和定量commbs試驗不小于1∶64;溶血素不小于1∶8;抗體滴度膠體法IgG抗D或抗E不小于1∶64。符合以上標(biāo)準(zhǔn)的30名孕婦服藥前共妊娠91次，其中人工流產(chǎn)15次，自然流產(chǎn)6次，分娩71次，娩出新生兒患溶血癥64次(90%)，新生兒死亡57例(89.1%)。

2.3.2 治療方法

孕婦自妊娠16周起口服六味降抗合劑至分娩，每次50 mL，早、晚各1次。

2.3.3 結(jié)果

血清免疫性抗體滴度的變化:治療前抗體滴度1∶64者4例，1∶128者 10例，1∶256者 8例，1∶512者 6例，1∶1 024者 2例。治療后抗體滴度1∶64者11例，1∶128者13例，1∶256者6例。用藥后免疫性抗體滴度的動態(tài)變化上升者1例，無變化者11例，下降者17例，無變化和下降者占93%。

新生兒發(fā)病情況:共娩出新生兒溶血癥患兒17名，發(fā)病率為56.6%，死亡率為0，與服藥前發(fā)病率(90%)及死亡率(89.1%)相比，P ＜0.01，有顯著性差異。

新生兒72 h內(nèi)血清膽紅素含量比較:經(jīng)藥物治療的30名孕婦娩出的新生兒72 h內(nèi)血清膽紅素不大于205μmol/L者12例(正常范圍)，大于205μmol/L者 18例，大于340μmol/L者4例，最高者為350μmol/L。30例中有既往新生兒情況記載的21名，新生兒72 h內(nèi)血清膽紅素全部大于340μmol/L，最高者達(dá)750μmol/L，對治療前后娩出的新生兒72 h內(nèi)血清膽紅素含量進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.01，有顯著性差異。

孕婦血清免疫性抗體滴度與新生兒發(fā)病的關(guān)系:新生兒患病組18例，其抗體滴度為1∶64者2例，1∶128者10例，1∶256者6例;非患病組12例，抗體滴度為1∶64者8例，1∶128者4例，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05，有顯著性差異。

3 討論

妊娠母兒血型不合導(dǎo)致的溶血現(xiàn)象，中醫(yī)認(rèn)為是熱毒侵襲，濕熱內(nèi)蘊(yùn)、氣血紊亂所致，以清熱瀉火解毒、利濕退黃、調(diào)和氣血為治療大法。方中用茵陳、黃芩、大黃清熱瀉火、利濕退黃為主藥，益母草、白芍、木香調(diào)合氣血，使氣機(jī)暢達(dá)、血脈調(diào)合為輔佐之藥。

藥理研究及臨床應(yīng)用證明，茵陳、黃芩等含有A(B)血型物質(zhì)，可在胎兒體內(nèi)與紅細(xì)胞競爭抗體，降低A(B)抗體對A(B)紅細(xì)胞的凝聚力，從而保護(hù)胎兒[3]。茵陳、黃芩、大黃、益母草、大黃均具有免疫抑制作用，對降低孕婦血清血型抗體效價有良好作用。對預(yù)防和治療胎兒和新生兒溶血癥及新生兒核黃疸有較好的療效。

[1]苗明三.現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:869，741.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:282，附錄 9，34，36.

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