固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定葛根中葛根素含量

蒲艷春，吳方評(píng)，楊宏健

葛根為豆科植物野葛 Pueraria loata(Willd.)Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛，在湖南西部、貴州等地分布極其廣泛，用于外感發(fā)熱、頭痛等癥?，F(xiàn)代研究證實(shí)，葛根中的主要有效成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物，具有抗炎解熱、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀動(dòng)脈血流量的作用，同時(shí)也有降低血壓的作用[1]。有關(guān)葛根素的測(cè)定研究已有不少的報(bào)道。2010年版《中國(guó)藥典(一部)》采用高效液相色譜法對(duì)葛根素含量進(jìn)行測(cè)定[2]，但在具體操作過程中葛根素與其他物質(zhì)吸收峰分離較差。本試驗(yàn)中通過固相萃取小柱預(yù)富集，30%的甲醇10 mL洗脫去雜，再用無(wú)水乙醇5 mL對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行洗脫，用高效液相色譜法對(duì)葛根素進(jìn)行測(cè)定，方法的分離度和重現(xiàn)性較好，特別是用C18固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行富集和除雜尚屬首次。該方法可用于葛根中葛根素的分離測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括單泵、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、Agilent漢化版色譜工作站、7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥;SK2200H型超聲清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);FA1004型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器廠);Sep－Park－C18固相萃取小柱(Waters公司)，Unic4802型紫外－可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)。葛根素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110752－200912，供含量測(cè)定用);葛根購(gòu)于湖南懷化懷仁大藥房，采收于2009年11月;水為2次蒸餾水;甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精確稱取葛根素對(duì)照品0.005 0 g，用5 mL的甲醇溶解，再用2次重蒸水定容至50 mL，即得0.100 0 g/L的葛根素對(duì)照品溶液。取少量葛根粉，過三號(hào)篩，精密稱取0.10 g，置具塞錐形瓶中，加入30%的乙醇水溶液50 mL，超聲提取30 min，過濾，提取液水浴蒸至無(wú)醇味，加入5 mL甲醇，振搖，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度;取25 mL樣品溶液，以5 mL/min的流速過預(yù)處理的Sep－Park－C18固相萃取小柱，先用30%的甲醇溶液10 mL洗脫除雜，再用5 mL無(wú)水乙醇以1 mL/min的流速洗脫，棄去最初的1 mL;水浴揮去乙醇，用流動(dòng)相溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件與試驗(yàn)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇－水(25∶75);流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):251 nm;進(jìn)樣量:20μL。在上述條件下的色譜圖見圖1?？梢姡鸶氐谋Ａ魰r(shí)間為2.910 min，且分離度較好。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取 0.1，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 質(zhì)量濃度為0.100 0 g/L的葛根素對(duì)照品溶液，用2次蒸餾水分別定容至 100，50，50，50，50 mL，分別得質(zhì)量濃度為 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL 的系列溶液，過 C18固相萃取小柱，乙醇洗脫，揮去乙醇，用流動(dòng)相分別定容至 10，5，5，5，5 mL，依法進(jìn)樣。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 A=3 987.28C －32.14，r=0.999 3(n=5)。結(jié)果表明，葛根中葛根素用C18固相萃取小柱富集后含量在0.1～1.6μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為1.6μg/mL的對(duì)照品溶液25 mL，用C18固相萃取小柱富集至5 mL，依法重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果峰面積的 RSD為0.93%。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品粉末5份，每份0.2 g，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果含量的 RSD為0.97%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于 0，1，2，3，4，6，8 h時(shí)依法進(jìn)樣。結(jié)果葛根素含量的 RSD為0.79%。

加樣回收試驗(yàn):精確稱取6批已知含量的葛根粉末0.01 g，每?jī)煞轂?組，分別加入葛根素對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法處理，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

精確稱取不同批次的樣品各5份，按供試品溶液制備方法進(jìn)行樣品處理，并按2.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣，用外標(biāo)法計(jì)算葛根中葛根素的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=5)

3 討論

葛根素的提取可用加熱回流、微波輔助提取和超聲提取等方法，考慮到提取效率和提取率，本試驗(yàn)采用了超聲提取法，并試驗(yàn)了不同的提取時(shí)間，結(jié)果在150 W功率下，超聲提取30 min可基本把葛根素提取完全。

由于乙醇對(duì)C18固相萃取材料的洗脫強(qiáng)度較大，葛根素在C18固相萃取小柱上不能保留，因此本試驗(yàn)通過除去乙醇，再改用低濃度甲醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行溶解，保證葛根素在C18固相萃取小柱上能充分地得到保留。洗脫除雜時(shí)試驗(yàn)了不同濃度的甲醇對(duì)葛根素的洗脫情況，當(dāng)甲醇濃度低于30%時(shí)，葛根素在固相萃取小柱上能較好保留，故用30%的甲醇對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行洗脫除去大部分的干擾雜質(zhì)，再用5 mL無(wú)水乙醇對(duì)葛根素進(jìn)行洗脫。

[1]章育中，楊 凡.高效液相色譜法測(cè)定葛根及其片劑中異黃酮的含量[J].藥物分析雜志，1984，4(2):67.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:312.