15味中草藥對(duì)5種臨床分離菌株的體外抑菌效果觀察

李成葉，王德海

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070)

中草藥作為一種無污染、綠色、天然的藥物，具有多能性、穩(wěn)定性和資源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小，已經(jīng)證實(shí)多種中草藥及其成分具有良好的抑菌或抗菌作用［1-4］，其作為替代抗生素解決抗藥性和藥物殘留等方面的優(yōu)勢(shì)越來越受到人們的重視。利用中草藥防治動(dòng)物疾病，既是飼養(yǎng)動(dòng)物的需要，也是人們生活保健的需求。

本實(shí)驗(yàn)以梔子、艾葉、百部、黃連、貫眾、魚腥草、夏枯草、蒲公英、大青葉、黃柏、黃芩、紫草、金銀花、敗醬草、連翹等15味中草藥對(duì)臨床分離的5株臨床分離細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、鏈球菌、雞大腸桿菌、仔豬大腸桿菌)的體外抑菌效果進(jìn)行觀察，從而為臨床應(yīng)用和科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 金黃色葡萄球菌菌株分離自患葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎雞的關(guān)節(jié)部位;白葡萄球菌分離自患葡萄球菌病鴨的肝臟部位;雞大腸桿菌分離自患大腸桿菌病雞的肝臟部位;鏈球菌分離自患鏈球菌性關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)部位;仔豬大腸桿菌分離自患大腸桿菌病仔豬的十二指腸部位。

以上菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理教研室分離、鑒定、保存，臨用前分別將供試菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h，用生理鹽水洗下菌苔，稀釋至濃度為1.2×1010CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2 試劑及藥品

1.2.1 供試中草藥 梔子、艾葉、百部、黃連、貫眾、魚腥草、夏枯草、蒲公英、大青葉、黃柏、黃芩、紫草、金銀花、敗醬草、連翹均購于湖北省武漢市天然藥物醫(yī)療研究院。

臨用前將各種中草藥分別稱取10 g，放入三角燒瓶中，加水100 mL浸泡30 min后加熱煮沸30 min，濾紙過濾取藥液，藥渣按以上方法再次浸泡、煮沸，合并兩次藥液，加熱煮沸濃縮至10 mL，即得每mL含1 g生藥的藥液。經(jīng)115℃高壓滅菌30 min并補(bǔ)足水分后備用。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 將15 mL、pH 7.4的滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察無菌生長后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)要求進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)。吸取20 μL制備的菌懸液加入制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基表面，均勻涂布，于室溫下干燥3～5 min后，用外徑6 mm的硬塑料管將涂布有菌懸液的基礎(chǔ)培養(yǎng)平板等間距對(duì)稱打孔4個(gè)，挑出孔中培養(yǎng)基，并在酒精燈火焰上對(duì)培養(yǎng)平板封底，將各種供試中草藥用蒸餾水稀釋成1.00 g/mL、0.75 g/mL、0.50 g/mL、0.25 g/mL、0.10 g/mL、0.05 g/mL 等6 個(gè)濃度，吸取藥液50 μL加入孔中，每種中草藥每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，然后將培養(yǎng)平板放入37℃溫箱培養(yǎng)18 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，同種中草藥同一濃度取其抑菌圈直徑的平均值，此即各種中草藥在不同濃度下對(duì)供試菌株的抑菌效果。1.4 抑菌效果判斷 參考NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。以抑菌圈直徑＞20 mm為極敏，15～20 mm之間為高敏，10～15 mm之間為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試中草藥對(duì)臨床分離金葡菌的抑菌效果詳見表1。

表1 15味中草藥對(duì)雞關(guān)節(jié)源性金葡菌的體外抑菌效果觀察

由表1可知，15種中草藥在1.00 g/mL濃度下除艾葉外對(duì)金黃色葡萄球菌都表現(xiàn)為極敏。其中，供試菌株對(duì)0.05g/mL濃度以上的金銀花，0.25 g/mL濃度以上的百部，0.50 g/mL濃度以上的黃芩，及0.75 g/mL濃度的梔子、貫眾、魚腥草、夏枯草、大青葉、敗醬草和連翹都表現(xiàn)為極敏。供試菌株表現(xiàn)為高敏的中草藥有0.05 g/mL濃度以上的百部和夏枯草，0.10 g/mL濃度以上的貫眾、魚腥草、大青葉和黃芩，0.25 g/mL濃度以上的梔子、紫草、敗醬草和連翹及0.50 g/mL濃度以上的艾葉、黃連、蒲公英和黃柏。表現(xiàn)為中敏的中草藥有0.05 g/mL濃度以上的黃連、貫眾、魚腥草、蒲公英、大青葉、黃芩、紫草、敗醬草和連翹，0.10 g/mL濃度以上的梔子和艾葉及0.25 g/mL濃度以上的黃柏。表現(xiàn)為低敏的有0.05 g/mL濃度的梔子，0.10 g/mL濃度以下的黃柏。而金黃色葡萄球菌對(duì)0.05 g/mL濃度的艾葉表現(xiàn)為耐藥。

2.2 供試中草藥對(duì)臨床分離白葡菌的抑菌效果詳見表2。

表2 15味中草藥對(duì)鴨肝臟源性白葡菌的體外抑菌效果觀察

由表2可知，15種中草藥在1.00 g/mL濃度時(shí)除梔子外對(duì)白葡萄球菌都表現(xiàn)為極敏。其中對(duì)0.10 g/mL濃度以上的黃芩和金銀花，0.50 g/mL濃度以上的艾葉、百部、貫眾、大青葉、紫草和敗醬草，0.75 g/mL濃度以上的黃連、夏枯草和連翹也表現(xiàn)為極敏。而0.05 g/mL濃度以上的貫眾、大青葉、紫草、黃芩和金銀花，0.10 g/mL濃度以上的百部、魚腥草、夏枯草和敗醬草，0.25 g/mL濃度以上的艾葉、黃連和連翹，蒲公英和黃柏分別在0.50 g/mL、0.75 g/mL濃度以上時(shí)都表現(xiàn)為高敏。對(duì)1.00 g/mL濃度的梔子表現(xiàn)為中敏，同樣表現(xiàn)為中敏的還有0.05 g/mL濃度的百部、魚腥草、夏枯草、敗醬草和連翹，0.10 g/mL濃度的黃連、蒲公英和連翹，0.25 g/mL濃度的蒲公英和黃柏及0.50 g/mL濃度的黃柏。供試菌株對(duì)0.75 g/mL和0.50 g/mL濃度的梔子，0.10 g/mL濃度的艾葉，0.05 g/mL濃度的黃連和蒲公英均表現(xiàn)為低敏。對(duì)0.25 g/mL濃度以下的梔子，0.10 g/mL濃度以下的黃柏及0.05 g/mL濃度的艾葉表現(xiàn)為耐藥。

2.3 供試中草藥對(duì)臨床分離鏈球菌的抑菌效果詳見表3。

表3 15味中草藥對(duì)豬關(guān)節(jié)源性鏈球菌的體外抑菌效果觀察

由表3可知，供試鏈球菌菌株對(duì)1.00 g/mL濃度的魚腥草、大青葉、黃柏、紫草和連翹，以及0.50 g/mL濃度以上的百部和金銀花均表現(xiàn)為極敏。對(duì)1.00 g/mL濃度的艾葉、貫眾、蒲公英、黃芩和敗醬草，0.75 g/mL 濃度的黃柏，0.50 g/mL 濃度以上的大青葉，0.25 g/mL濃度以上的百部、紫草和連翹及0.10 g/mL濃度以上的魚腥草和金銀花均表現(xiàn)為高敏。表現(xiàn)為中敏的藥物有0.75 g/mL濃度以上的梔子和艾葉，0.50 g/mL濃度以上的黃連、蒲公英和敗醬草，0.25 g/mL濃度以上的大青葉和黃柏，0.05 g/mL濃度以上的貫眾、魚腥草、紫草、金銀花和連翹。而對(duì)0.50 g/mL濃度的梔子和艾葉，0.25 g/mL濃度的蒲公英和敗醬草，0.10 g/mL濃度的百部和大青葉，0.05 g/mL濃度的大青葉均表現(xiàn)為低敏。表現(xiàn)為耐藥的中草藥有夏枯草，0.75 g/mL濃度以下的黃芩，0.25 g/mL濃度以下的梔子、艾葉和黃連，0.10 g/mL濃度以下的蒲公英、黃柏和敗醬草。

2.4 供試中草藥對(duì)臨床分離雞肝臟源性大腸桿菌的抑菌效果 詳見表4。

表4 15味中草藥在不同濃度下對(duì)雞肝臟源性大腸桿菌的體外抑菌效果

由表4可知，供試大腸桿菌菌株只對(duì)1.00 g/mL濃度的敗醬草和連翹，0.75 g/mL濃度以上的大青葉和黃芩表現(xiàn)為極敏。而對(duì)1.00 g/mL濃度的梔子、艾葉、百部、蒲公英和黃柏，0.50 g/mL濃度以上的大青葉和紫草，0.25 g/mL濃度以上的連翹，0.10 g/mL濃度以上的黃芩表現(xiàn)為高敏。而對(duì)1.00 g/mL濃度的夏枯草，0.75 g/mL濃度以上的梔子、百部和黃連，0.50 g/mL濃度的艾葉，0.25 g/mL濃度的大青葉，0.10 g/mL濃度以上的蒲公英、紫草和敗醬草及0.05 g/mL濃度以上的黃芩和連翹表現(xiàn)為中敏。而對(duì)0.25 g/mL濃度的艾葉，0.10 g/mL濃度的大青葉和0.05 g/mL濃度的蒲公英、紫草和敗醬草表現(xiàn)為低敏。而對(duì)貫眾、魚腥草和金銀花及0.75 g/mL濃度的夏枯草，0.50 g/mL濃度的梔子、百部、黃連和黃柏及0.10 g/mL濃度的艾葉和0.05 g/mL濃度的大青葉均表現(xiàn)為耐藥。

2.5 供試中草藥對(duì)仔豬腸源性大腸桿菌的抑菌效果 詳見表5。

表5 15味中草藥對(duì)仔豬十二指腸源性大腸桿菌的體外抑菌效果觀察

由表5可知，供試大腸桿菌菌株只對(duì)1.00 g/mL濃度的大青葉、連翹、金銀花及0.50 g/mL濃度以上的敗醬草表現(xiàn)為極敏。對(duì)1.00 g/mL濃度的艾葉和蒲公英，0.75 g/mL濃度以上的梔子、大青葉和紫草，0.50 g/mL濃度以上的金銀花、黃芩及0.25 g/mL濃度的敗醬草、0.10 g/mL濃度以上的連翹表現(xiàn)為高敏。表現(xiàn)為中敏的藥物有1.00 g/mL濃度的貫眾和黃柏，0.75 g/mL濃度以上的百部、黃連和夏枯草，0.50 g/mL濃度的梔子和大青葉，0.25 g/mL濃度以上的蒲公英，0.10 g/mL濃度以上的黃芩和0.05 g/mL濃度以上的紫草、連翹、敗醬草和金銀花。表現(xiàn)為低敏的藥物有0.75 g/mL濃度的艾葉，0.50 g/mL濃度的黃連，0.25 g/mL濃度的大青葉和0.10 g/mL濃度以下的蒲公英。表現(xiàn)為耐藥的中草藥有魚腥草，0.75 g/mL濃度以下的貫眾和黃柏，0.50 g/mL濃度以下的艾葉、夏枯草和百部，0.25 g/mL濃度以下的梔子和黃連，0.10 g/mL濃度以下的大青葉和0.05 g/mL濃度的黃芩。

3 小結(jié)與討論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐青霉素鏈球菌(PRP)已成為目前一些大型綜合醫(yī)院常見的院內(nèi)感染菌，常表現(xiàn)為多重耐藥性［5］。大腸桿菌是獸醫(yī)臨床常見的病原菌之一，由于該病一直依靠抗生素進(jìn)行控制，耐藥性越來越嚴(yán)重。為保證食品安全和生產(chǎn)效益，不用抗生素提高畜禽的抗病力不僅有利于動(dòng)物健康、動(dòng)物福利和生產(chǎn)效率，而且還可提高畜禽生產(chǎn)中的微生物安全。

本試驗(yàn)所選用的15味中草藥為臨床用于疾病防治的常用藥物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期驗(yàn)證，在疾病防治方面療效確切，如用于奶牛乳房炎、仔豬腹瀉及雞葡萄球菌病等的防治方面，都顯示了明顯效果。由于中草藥天然性和多能性的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中一方面對(duì)相關(guān)疾病具有防治作用，同時(shí)又可調(diào)控機(jī)體的平衡，起到調(diào)節(jié)臟腑和陰陽平衡的作用，有助于提高畜禽自身的免疫力和生產(chǎn)力，因此利用中草藥防治動(dòng)物疾病，已成為當(dāng)前畜牧獸醫(yī)界的一個(gè)熱點(diǎn)課題。

本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同種類中草藥對(duì)不同菌株的抗菌效果不同，且對(duì)G+菌株和G－菌株的抑菌效果有明顯差異，百部、金銀花、魚腥草、連翹、黃柏、紫草、大青葉等7味中草藥對(duì)G+菌株抑菌效果明顯，敗醬草、大青葉、金銀花和連翹則對(duì)大腸桿菌具有明顯的體外抑菌效果。這可能與藥物本身所含成分有關(guān)外，藥物的作用機(jī)制(如影響細(xì)菌細(xì)胞壁或抑制細(xì)菌內(nèi)某些酶，如DNA聚合酶、RNA聚合酶等的活性)發(fā)揮了重要作用。在15味中草藥中，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較差的貫眾和魚腥草，對(duì)G+則具有明顯的抑菌效果，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與細(xì)菌自身所含有的脂多糖、磷脂、蛋白質(zhì)和脂蛋白復(fù)合物組成的三層外胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，在中草藥飼料添加劑的配伍方面，除對(duì)分離菌株進(jìn)行生化分析外，還應(yīng)進(jìn)行藥物敏感性的試驗(yàn)研究。

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