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    平喘寧對(duì)哮喘大鼠肺組織cAMP/cGMP及TGF-β1mRNA表達(dá)的影響

    2012-06-22 01:19:16方向明袁亞美王麗娜
    關(guān)鍵詞:寒性平喘試劑盒

    方向明,袁亞美,王麗娜,胡 謙

    (安徽中醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230038)

    平喘寧為治療臨床寒性哮喘的有效方劑,由射干麻黃湯和三子養(yǎng)親湯化裁而成,功效溫肺化痰、止咳平喘、息風(fēng)止痙,治療寒哮。第二信使cAMP、cGMP可能是陰陽學(xué)說的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,多篇文獻(xiàn)報(bào)道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值降低是陽虛證的特征,是判斷肺陽虛模型復(fù)制成功的指標(biāo)。TGF-β是已知最強(qiáng)的致纖維化因子之一[1],其功能的發(fā)揮主要取決于TGF-β1。肺組織中的TGF-β1基因表達(dá)強(qiáng)度與膠原的含量成明顯正相關(guān)[2],并作為TGF家族的多效細(xì)胞因子,在氣道高反應(yīng)性(AHR)與氣道急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制性作用。但在氣道受到抗原的反復(fù)刺激造成慢性炎癥時(shí),氣道中的TGF-β1持續(xù)性增高,進(jìn)而引起或促進(jìn)氣道重建和肺組織纖維化[3-4]。該實(shí)驗(yàn)通過平喘寧干預(yù)寒性哮喘大鼠模型,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR),檢測(cè)哮喘大鼠肺臟的TGF-β1mRNA表達(dá)水平,研究該藥治療寒性哮喘的分子生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8月齡健康雄性Wistar大鼠70只,體重200 g~220 g,普通級(jí),安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(皖)2011-002。

    1.1.2 藥物與試劑 平喘寧方藥組成:麻黃、杏仁、蘇子、半夏等,飲片來源:安徽中醫(yī)學(xué)院國(guó)醫(yī)堂制劑中心,分別煎制成3級(jí)濃度生藥,濃度分別為4.2 g/mL(大劑量)、2.1 g/mL(中劑量)、1.05 g/mL(小劑量)。地塞米松片:上海信誼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號(hào):030402);桂龍咳喘寧:山西桂龍醫(yī)藥有限公司(批號(hào):Z20053135)。卵蛋白(OVA)(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):A8040),3%戊巴比妥鈉(德國(guó)Merok公司,批號(hào):20070923),SP免疫組化染色試劑盒(中山生物技術(shù)有限公司),DAB顯色劑試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司),目的基因和GAPDH引物(上海捷瑞生物技術(shù)有限公司),DEPC(美國(guó)Gibico公司),EB(美國(guó)Sigma公司)。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 402AI型魚躍牌超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司);CX21型光學(xué)顯微鏡,BX51型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);DNA擴(kuò)增儀、DU640紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Backman公司);Eagle EyeⅡ凝膠成像儀(AGENE公司);DYYⅢ2型電泳儀(北京六一儀器廠);玻璃勻漿器(中國(guó)科大生物技術(shù)有限公司);Speetra classic酶標(biāo)分析儀(Austria公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 哮喘模型制備及標(biāo)本采集 將70只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組[0.4 mg/(kg·d)]、桂龍咳喘寧組[10 g/(kg·d)],平喘寧低劑量組[4.9 g/(kg·d)]、平喘寧中劑量組[9.8 g/(kg·d)]、平喘寧高劑量組[19.6 g/(kg·d)]7組,每組10只。第1天、第8天采用大鼠腹腔注射100 g/L卵蛋白生理鹽水混懸液1 mL致敏。采用10 g/L卵蛋白溶液超聲霧化20 min~30 min,1次/d,連續(xù)7 d,致大鼠出現(xiàn)點(diǎn)頭、身顫、節(jié)律性收腹樣喘促等現(xiàn)象,提示模型復(fù)制成功。第15天給藥與誘喘同時(shí)進(jìn)行,并給予寒冷刺激,連續(xù)4 w。給藥采用誘喘前30 min灌胃,空白對(duì)照組、模型組每天給予等量蒸餾水灌服。末次激發(fā)1 h后,采用腹腔注射水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉大鼠,打開胸腔,取右肺和左肺組織放入凍存管中,置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 cAMP/cGMP檢測(cè) 按試劑盒說明書進(jìn)行,該試劑盒為酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。利用抗原能吸附到固相載體表面的特性,使cAMP、cGMP抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行,分離cAMP、cGMP抗原抗體結(jié)合物,在450 nm波長(zhǎng)的條件下用酶標(biāo)儀獲取吸光度(OD值),并測(cè)算cAMP、cGMP 濃度。

    1.2.3 TGF-β1mRNA測(cè)定 根據(jù)cDNA文庫與相關(guān)文獻(xiàn)[5],引物由上海捷瑞生物工程有限公司(ISO9001:2008)設(shè)計(jì)合成。TGF-β1擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度:231 bp,F(xiàn)orward primer:5′-TGGTGGACCGCAACAACGCAAT-3′,Reverse primer:5′-TGGGGGTCAGCAGCCGGT TA-3′;GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度:431 bp,F(xiàn)orward primer:5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCC CTG-3′,Reverse primer:5′-AGGTGAGCCCCAGCCTTCTCC-3′。取100 mg肺組織放于勻漿管內(nèi),冰上操作,加入1 mL Trizol溶液,研磨組織后,倒入1.5 mL EP管中,混勻室溫靜置5 min后,每1 mL Trizol溶液中加0.2 mL氯仿,混勻室溫靜置5 min后,15 000 rmp離心15 min。將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中,加入0.5 mL異丙醇,混勻后置于-20℃1 h。然后12 000 rmp離心10 min,留取沉淀,加入1 mL 75%乙醇,振蕩洗滌RNA沉淀1次,后7 500 rmp離心5 min,小心倒掉上清,置于超凈工作臺(tái)吹干沉淀,再在管中加入20 μL DEPC水溶解完全,即得大鼠肺組織總RNA。取5 μL總RNA點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠電泳,Eagle EyeⅡ凝膠成像儀觀察電泳條帶,并用DU640紫外分光光度計(jì)測(cè)算RNA260nm/280nm比值。逆轉(zhuǎn)錄(RT):取2μL總RNA加10mMdNTPMix2μL、Oligo(dT)18primer 1 μL 于 100μL EP 管中,再加 Water,nuclease-free 9 μL,5×Reaction buffer 4 μL、Revert AidTMMMulvReverseTranscriptase1 μL,RiboLockTMRNase Inhibitor 1 μL于反應(yīng)管中,42℃水浴60 min,70℃水浴5 min以失活逆轉(zhuǎn)錄酶終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),冰浴冷卻,即得cDNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):先將 TGF-β1、GAPDH 兩對(duì)引物稀釋至濃度為10 pmol。加樣依照如下體系進(jìn)行:cDNA 2 μL,10 pmol Forward primer 1 μL,10 pmol Reverse primer 1 μL,nuclease free water 8.5 μL,PCR Master Mix(2×)12.5 μL,低速離心混勻。反應(yīng)條件:TGF-beta1:變性 40 s,95℃;退火60℃,40 s;72℃延伸,40 s;共進(jìn)行 34個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸7 min,擴(kuò)增長(zhǎng)度片段231 bp。GAPDH:變性 40 s,95℃;退火 60 ℃,40 s;72 ℃延伸,40 s;共進(jìn)行 34個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸7 min,擴(kuò)增長(zhǎng)度片段431 bp。PCR產(chǎn)物電泳分析:分別取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL DNA加樣緩沖液混勻,以1%瓊脂糖凝膠電泳,同時(shí)加100 bp Marker,其結(jié)果用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀分析:①確定產(chǎn)物位置;②光密度值掃描(密度代表基因表達(dá)豐度);③半定量計(jì)算:TGF-β1mRNA表達(dá)豐度/GAPDH表達(dá)豐度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 cAMP/cGMP檢測(cè)結(jié)果

    各組大鼠肺組織cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值測(cè)算如下,結(jié)果見表1。

    表1 大鼠肺組織cAMP、cGMP含量參數(shù)比較 (nmol/L,)

    表1 大鼠肺組織cAMP、cGMP含量參數(shù)比較 (nmol/L,)

    注:與模型組比較,1)P<0.05,2)P<0.01

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    由表1可知,與模型組比較,平喘寧各劑量組肺組cGMP含量降低,cAMP/cGMP升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

    2.2 總RNA純度測(cè)定

    各組總 RNA 260 nm/280 nm 平均比值為 1.8~2.0[6],表明總RNA基本無蛋白質(zhì)污染與降解,RNA純度較好。結(jié)果見表2。

    表2 各組大鼠肺組織總RNA純度比較

    2.3 TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量

    TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量,以GAPDH為內(nèi)參,各組PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳,用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀分析。與模型組比較,平喘寧各劑量組PGF-β1-mRNA 表達(dá)率度降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見表3,圖1。

    表3 各組TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量比較 ()

    表3 各組TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量比較 ()

    注:與空白對(duì)照組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01

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    3 討論

    第二信使cAMP、cGMP可能是陰陽學(xué)說的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,具有相互拮抗制約的生物學(xué)效應(yīng)。多家文獻(xiàn)報(bào)道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降是陽虛證的表現(xiàn)。在肺組織中,cAMP含量上升則舒張支氣管平滑肌,支氣管得以擴(kuò)張;與之相反,cGMP含量上升則收縮支氣管平滑肌,誘發(fā)哮喘[5-7]。該實(shí)驗(yàn)顯示模型組較空白對(duì)照組cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降(P<0.01);治療組較模型組cGMP含量降低、cAMP/cGMP比值上升(P<0.01,P<0.05)。證明肺陽虛大鼠模型復(fù)制成功,并為平喘寧治療寒性哮喘提供了合理性依據(jù)。

    支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其分泌的炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子共同參與的氣道慢性炎癥,支氣管上皮細(xì)胞與氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)也參與了這個(gè)炎癥過程,而氣道重構(gòu)則是慢性哮喘反復(fù)發(fā)作的病理學(xué)基礎(chǔ),是氣流受限甚至不可逆的主要原因,可加重氣道高反應(yīng)性。氣道上皮下纖維化、ASMC增生與肥大是氣道收縮與重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)。TGF-β1參與激活ERK通路,嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞都可以分泌 TGF-β1[8-9]。TGF-β1結(jié)合胞膜表面受體,激活Ras-Raf-MEK-ERK通路,ERK磷酸化后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與轉(zhuǎn)錄因子相互作用,進(jìn)而影響相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致細(xì)胞的特異性表達(dá)。TGF-β1在促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間沉積與纖維細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用,因此TGF-β1在哮喘發(fā)病中起重要作用。平喘寧由射干麻黃湯與三子養(yǎng)親湯化裁而成,功效溫肺化痰、止咳平喘、祛風(fēng)解痙,主治寒性哮喘。在實(shí)驗(yàn)過程中,模型組、地塞米松組、平喘寧高、中劑量組各死亡1只大鼠,桂龍咳喘寧組、低劑量組死亡2只大鼠,主要在造模、灌胃給藥過程中,原因可能與大鼠過敏有關(guān)。

    該研究顯示平喘寧能夠顯著降低寒性哮喘大鼠肺組織中TGF-β1RNA的表達(dá)水平,從而減輕或逆轉(zhuǎn)氣道重構(gòu),降低氣流受限程度,這可能即是平喘寧有效治療寒性哮喘的分子機(jī)制之一。

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