HMGB1、VEGF和MMP-7的相關(guān)性及其與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系

史振軍，馬海芝，楊振淮，邱萬壽

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510130；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510635）

高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1，HMGB1)在多種腫瘤中過度表達(dá)，其水平遠(yuǎn)高于相對應(yīng)的正常組織，且可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、病灶大小、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與腫瘤血管生成密切相關(guān),是促進(jìn)腫瘤血管生成的眾多因子中最重要的一種?；|(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)可融解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。我們用免疫組化方法檢測人結(jié)直腸癌組織中HMGB1、VEGF、及MMP-7表達(dá)情況,以探討三者在結(jié)直腸癌中的相關(guān)性及其與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2001年1月至2010年10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州市中醫(yī)院普外科病理診斷為結(jié)直腸癌的腫瘤組織70例、癌旁組織20例及內(nèi)鏡室正常黏膜組織20例。70例結(jié)直腸癌患者中，男性46例(46.9%)，女性24例(53.1%)；年齡最大76歲，最小29歲，中位年齡56歲，其中＜60歲33例，≥60歲37例；腫瘤直徑＜5 cm 34例，≥5 cm 36例；肝轉(zhuǎn)移20例；高分化27例，中低分化腺癌39例，黏液腺癌2例，管狀腺癌1例，腺瘤癌變1例；浸潤深度達(dá)肌層22例，漿膜及漿膜外48例；根據(jù)UICC 2002年分期標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～I(xiàn)V期36例；結(jié)腸癌37例，直腸癌33例。其他兩組一般資料與結(jié)直腸癌組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有可比性。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人HMGB1單克隆抗體、羊抗人MMP-7單克隆抗體SP試劑盒均購于北京中杉生物公司。微波爐(Leica公司)、復(fù)溫箱(Leica公司)、Leica1203型切片機(jī)(Leica公司)、Olympus顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)、Leica1220 型烤箱(Leica公司)、Olympus BH2光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學(xué) 全部臘塊4 μm厚連續(xù)切片4張，用EnVision兩步法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染、封片。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化染色陽性反應(yīng)為細(xì)胞漿或胞核中出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒。參考Kawasaki等[2]報道的方法，根據(jù)染色的強(qiáng)度及陽性細(xì)胞的面積判斷結(jié)果。每張切片陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分為四個等級。每張切片選擇有代表性的區(qū)域，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色面積＞20%為陽性，在200倍視野下進(jìn)行計數(shù)共計5個視野，取其平均值避免隨意性。VEGF蛋白陽性染色定位于細(xì)胞胞漿(呈棕黃色顆粒)；HMGB1蛋白陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)(呈棕黃色顆粒)；MMP-7蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和胞膜上(呈棕黃色或淺棕色顆粒)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布。結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計包裝軟件進(jìn)行分析處理。根據(jù)數(shù)據(jù)特征進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)所有免疫組化切片均由兩名病理科主治醫(yī)師雙盲法讀片，差異出現(xiàn)5%～10%，然后共同決定診斷。

2.1 HMGB1、VEGF、MMP-7 在結(jié)直腸正常組織、癌旁組織及結(jié)直腸癌中的表達(dá) 在正常組織中VEGF、MMP-7不表達(dá)，HMGB1僅1例表達(dá)；在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，分別為50例、52例、46例，在癌旁組織中低度表達(dá)，分別為6例、7例、4例。3項(xiàng)指標(biāo)各組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)，見表1。

表1 HGM1、VEGF、MMP-7在結(jié)直腸正常組織、癌旁組織及結(jié)直腸癌中的表達(dá)[例（%）]

2.2 結(jié)直腸癌組織中VEGF、HMGB1、MMP-7的表達(dá)量與臨床指標(biāo)的關(guān)系 VEGF、HMGB1、MMP-7的表達(dá)與患者腫瘤部位、性別、年齡、腫瘤直徑大小無關(guān)，而與腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且隨著腫瘤的惡化程度、轉(zhuǎn)移其表達(dá)呈遞增性，說明三項(xiàng)指標(biāo)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中VEGF、HMGB1、MMP-7的表達(dá)量與臨床指標(biāo)關(guān)系[例（%）]

2.3 VEGF、HMGB1、MMP-7在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性 經(jīng)列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析HMGB1、MMP-7、VEGF在結(jié)直腸癌的表達(dá)均具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)。關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.6，說明三者具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，協(xié)同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，見表3。

表3 VEGF、HMGB1、MMP-7在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多階段、多基因參與的復(fù)雜過程。有學(xué)者提出多基因協(xié)同學(xué)說，認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段至少有兩個及以上功能不同的異常激活的癌基因各自發(fā)揮著不同的作用，并在時間與空間上相互配合，協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞的癌變和轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)已公認(rèn)，新生的微血管是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的第一站，隨著腫瘤微血管計數(shù)(MVD)的增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的危險潛能也明顯增加，腫瘤微血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在血管新生過程中起了至關(guān)重要的作用。VEGF是血管生成過程最重要的正向調(diào)控因子,與多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3]。研究表明HMGB1在正常組織中很少表達(dá)，在組織損傷、炎癥、腫瘤等情況下表達(dá)增強(qiáng)，可能參與腫瘤的增殖、侵襲、分化及凋亡等，說明與惡性腫瘤的形成和發(fā)展相關(guān)[4]。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移必須穿越組織自然屏障向遠(yuǎn)離原發(fā)瘤部位移動，細(xì)胞間基質(zhì)和基底膜組成的細(xì)胞外基質(zhì)對防御腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用，細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的天然屏障，基質(zhì)溶解必然會促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。有人認(rèn)為MMP-7是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶[5]，同時可促進(jìn)腫瘤血管的生長，在小血管、毛細(xì)血管末梢形成及血管內(nèi)皮基膜形成的過程中起重要作用。

本研究中：在20例結(jié)直腸正常黏膜標(biāo)本中VEGF、MMP-7不顯示；在20例結(jié)直腸癌旁組織VEGF、HMGB1及MMP-7陽性表達(dá)分別為6例、7例、4例，表達(dá)率分別為30%、35%、20%。而在惡性腫瘤中三項(xiàng)指標(biāo)陽性表達(dá)分別50例、52例、46例，表達(dá)率分別為71.4%、74.3%、65.7%。結(jié)直腸癌組織與癌旁組織、正常組織差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。所測結(jié)果高于國外相關(guān)報道，可能與我們所取研究對象多為進(jìn)展期有關(guān)。同時本研究還發(fā)現(xiàn)VEGF、HMGB1及MMP-7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑大小、腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，并且隨著腫瘤惡性程度、TME分期等的進(jìn)展，其陽性表達(dá)呈遞增性。

經(jīng)列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析我們發(fā)現(xiàn)：HMGB1、MMP-7、VEGF在結(jié)直腸癌的表達(dá)均具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)，其關(guān)聯(lián)系數(shù)I值均大于0.6，說明三者具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，VEGF、MMP-7的蛋白表達(dá)與HMGB1的強(qiáng)表達(dá)明顯相關(guān)。

因此，筆者認(rèn)為：HMGB1、MMP-7、VEGF三者具有正相關(guān)性，相互影響，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而HMGB1可能通過誘導(dǎo)VEGF、MMP-7的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤新生血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，HMGB1、VEGF、MMP-7的聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌的病理分期、預(yù)后判斷及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義，可作為較為可靠的聯(lián)合檢測指標(biāo)。

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