MMP-13在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及對(duì)患者術(shù)后生存期的影響

楊 波，唐伏秋

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院腫瘤科1、干部病房二科2，湖北 武漢 430070）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，來(lái)源于神經(jīng)上皮組織，病理學(xué)分級(jí)屬WHOⅣ級(jí)星形細(xì)胞瘤。常見(jiàn)的發(fā)病年齡為45～65歲，老年男性多見(jiàn)，多以顱內(nèi)高壓癥狀或神經(jīng)功能障礙癥狀起病、病程短、進(jìn)展快、死亡率高。雖然目前臨床上采用了手術(shù)為主，輔以術(shù)后放療、化療、免疫治療的綜合治療措施，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的療效仍然不理想，患者生存期短，預(yù)后差。為了改善膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后，延長(zhǎng)生存期，必須深入研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲的機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)。基質(zhì)金屬蛋白酶是一種鋅離子依賴(lài)的蛋白水解酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原、明膠、蛋白多糖、層粘連蛋白等多種成份，與結(jié)腸癌、肺癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲密切相關(guān)[1-2]。為了解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶13(Matrix metalloproteinase-13，MMP-13)的表達(dá)及其與患者術(shù)后生存期之間的相關(guān)性，我們采用免疫組化學(xué)法檢測(cè)了31例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織標(biāo)本中MMP-13的表達(dá)，比較MMP-13強(qiáng)表達(dá)組與弱表達(dá)組患者術(shù)后生存期的差異，報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2008年1月至2010年6月首次手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的石蠟組織標(biāo)本31例，所有病例均系廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者，經(jīng)過(guò)影像學(xué)及術(shù)后病理確診為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，術(shù)前均未行放療、化療和免疫治療等抗腫瘤治療。其中男20例，女11例，年齡33～65歲，平均51.6歲。電話隨訪患者的生存期，隨訪日期截止至2011年6月1日。

1.2 主要試劑 小鼠抗人MMP-13單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abnova公司，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒等試劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 方法 采用免疫組化兩步法：以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS沖洗3次，每次3 min。高壓鍋煮沸對(duì)組織抗原進(jìn)行修復(fù)，每張切片加1滴或50 μl 3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl的小鼠抗人MMP-13單克隆抗體，4℃過(guò)夜。PBS液洗3遍，每次3 min，每張切片加1滴或50 μl即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min掌握顯色程度。自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染。之后切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.4 MMP-13染色結(jié)果判定 MMP-13陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞中，胞漿呈程度不同、基本均勻的棕黃色顆粒反應(yīng)，強(qiáng)表達(dá)者呈黃褐色。由兩名獨(dú)立的病理科醫(yī)師根據(jù)組織切片的染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行半定量染色評(píng)分，染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：0=陰性，1=弱陽(yáng)性，2=陽(yáng)性，3=強(qiáng)陽(yáng)性；染色面積的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：0=陰性，Ⅰ＜10%，Ⅱ 10～50%，Ⅲ＞50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，術(shù)后生存期的比較用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MMP-13在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá) 如圖1所示，MMP-13在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本組織中的表達(dá)主要集中在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，顯微鏡觀察呈程度不同的黃色、黃褐色染色。31例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本按照Tirapelli等[3]報(bào)道的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫組化評(píng)分方法（詳見(jiàn)材料與方法1.4）判定染色評(píng)分，將染色強(qiáng)度與染色面積評(píng)分相加，總評(píng)分0分為陰性，1～2分為弱陽(yáng)性，3～4分為陽(yáng)性，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性。其中MMP-7陰性表達(dá)7例，弱陽(yáng)性表達(dá)8例，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)16例，總表達(dá)率（弱陽(yáng)性表達(dá)組+陽(yáng)性表達(dá)組+強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)組）達(dá)77.4%。強(qiáng)表達(dá)組（陽(yáng)性表達(dá)組+強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)組）16例，占51.6%。弱表達(dá)組（陰性表達(dá)組+弱陽(yáng)性表達(dá)組）15例，占48.4%。

圖1 免疫組化檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織MMP-13的表達(dá)(×200)

2.2 MMP-13表達(dá)的強(qiáng)弱與患者術(shù)后生存期的關(guān)系 31例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，MMP-13強(qiáng)表達(dá)組16例，刪除1例（患者仍生存）。MMP-13弱表達(dá)組15例，刪除3例（患者仍生存）。如圖2所示，MMP-13強(qiáng)表達(dá)組生存期明顯短于MMP7弱表達(dá)組（P＜0.0001，χ2=18.275)。

圖2 31例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是高度惡性的Ⅳ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，可以是顱內(nèi)原發(fā)，也可以由間變性星形細(xì)胞瘤進(jìn)一步惡變而來(lái)，病理學(xué)又分為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和巨細(xì)胞型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤鏡下可見(jiàn)瘤細(xì)胞密集，有明顯異型性，常常伴出血、壞死，血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯增生。腫瘤發(fā)展迅速，預(yù)后差，患者多在兩年內(nèi)死亡[4]。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移通常包括以下三個(gè)步驟：①腫瘤細(xì)胞粘附基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，通過(guò)各種蛋白水解酶降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成份；②腫瘤細(xì)胞在各種趨化因子的作用下聚集和移行；③腫瘤細(xì)胞隨血管和淋巴管轉(zhuǎn)移至他處繼續(xù)增殖。其中，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是惡性腫瘤侵襲的重要步驟，而基質(zhì)金屬蛋白酶在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶可以分為5個(gè)亞類(lèi)：膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和其他類(lèi)[5]。MMP-13與MMP-1、MMP-8同屬于膠原酶亞類(lèi)，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中一個(gè)重要的成員，它主要由腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞分泌，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等成份。特別是Ⅱ、Ⅳ型膠原，是MMP-13的主要作用底物[6-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MMP-13的高表達(dá)與乳腺癌、結(jié)腸癌、軟骨肉瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。Zhang等[8]用免疫組化法檢測(cè)了263例乳腺癌石蠟包埋組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)MMP-13蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，MMP-13在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.001）和腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.001）都與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP-13在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)與Her-2(P=0.015）和TIMP-1（P＜0.010）的表達(dá)也密切相關(guān)。MMP-13在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)還與腫瘤的侵襲性表型密切相關(guān)。高水平表達(dá)的MMP-13與患者的不良預(yù)后有關(guān)，MMP-13是決定乳腺癌患者預(yù)后和生存的獨(dú)立因素。Elke等[9]用半定量RT-PCR法檢測(cè)了30例結(jié)腸癌組織和遠(yuǎn)端正常腸黏膜組織中MMP-13表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-13 mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在正常腸黏膜組織中的表達(dá)（P=0.023）。Curran等[10]用免疫組化法檢測(cè)了90例Dukes'C結(jié)腸癌患者腫瘤組織中MMP-13的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-13的表達(dá)強(qiáng)弱與患者的術(shù)后生存期呈反比，MMP-13是決定結(jié)腸癌患者預(yù)后和生存的獨(dú)立因素。

雖然MMP-13在乳腺癌、結(jié)腸癌、軟骨肉瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后和生存密切相關(guān)，但其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究資料尚不多。本研究結(jié)果顯示，MMP-13在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中總表達(dá)率為77.4%，Kaplan-Meier生存曲線分析和Log-rank檢驗(yàn)比較，MMP-13強(qiáng)表達(dá)組術(shù)后生存期明顯低于弱表達(dá)組，這表明MMP-13在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)可能與腫瘤的惡性增殖、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，并影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后和術(shù)后生存。對(duì)于其通過(guò)影響哪些靶分子或靶基因來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲，還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1]Klinge U,Rosch R,Junge K,et al.Different matrix micro-environments in colon cancer and diverticular disease[J].Int J Colorectal Dis,2007,22(5)：515-520.

[2]Morrison CJ,Butler GS,Rodríguez D.Matrix metalloproteinase proteomics：substrates,targets,and therapy[J].Curr Opin Cell Biol,2009,21(5)：645-653.

[3]Tirapelli LF,Bolini PH,Tirapelli DP,et al.Caspase-3 and Bcl-2 expression in glioblastoma：an immunohistochemical study[J].Arq Neuropsiquiatr,2010,68(4)：603-607.

[4]Clarke J,Butowski N,Chang S.Recent advances in therapy for glioblastoma[J].Arch Neurol,2010,67(3)：279-283.

[5]Sternlicht MD,Werb Z.How matrix metalloproteinases regulate cell behavior[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2001,17(1)：463-516.

[6]Knauper V,Lopez-Otin C,Smith B,et al.Biochemical characterization of human collagenase-3[J].J Biol Chem,1996,271(3)：1544-1550.

[7]Deng SJ,Bickett DM,Mitchell JL,et al.Substrate specificity of human collagenase 3 assessed using a phage-displayed peptide library[J].J Biol Chem,2000,275(40)：31422-31427.

[8]Zhang B,Cao XC,Liu YX,et al.Tumor-derived matrix metalloproteinase-13(MMP-13)correlates with poor prognoses of invasive breast cancer[J].BMC Cancer,2008,8(8)：83-92.

[9]Roeb E,Arndt M,Jansen B,et al.Simultaneous determination of matrix metalloproteinase(MMP)-7,MMP-1,-3,and-13 gene expression by multiplex PCR in colorectal carcinomas[J].Int J Colorectal Dis,2004,19(10)：518-524.

[10]Curran s,Dundas SR,Buxton J,et al.Matrix metalloproteinase/tissue inhibitors of matrix metalloproteinase phenotype identifies poor prognosis colorectal Cancers[J].Clinical Cancer Research,2004,10(24)：8229-8234.