宮頸癌cyclin G1表達與臨床病理因素關系的研究

翁玉英 林東紅 吳荔香 林德馨 成 玲 薛曉光 陳光榮 廖 翏

(福建省婦幼保健院檢驗科，福州 350001)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病原因目前尚不清楚，國內(nèi)外大量資料證實，早婚、早育、多產(chǎn)、性生活紊亂以及有人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染的婦女有較高患病率。近年來有研究表明，宮頸癌的發(fā)生還與細胞周期蛋白(cyclins)的表達和調控異常密切相關。許多資料顯示，在已發(fā)現(xiàn)的cyclins(A～I)九個成員中，cyclin B、D、E的表達與宮頸癌密切相關。cyclin G1是一類發(fā)現(xiàn)較晚的細胞周期蛋白G的一個亞型，其確切功能尚未完全認識清楚，它與宮頸癌關系的研究也鮮為報道。本課題組之前研究報道了CIN和宮頸癌中cyclin G1蛋白的表達與HPV分子亞型感染情況，結果顯示cyclin G1蛋白在宮頸癌中高表達，并與高危型HPV有顯著正相關［1］。本實驗進一步研究cyclin G1 mRNA和cyclin G1蛋白在CIN和宮頸癌中的表達及其相關性，并分析其與臨床病理因素的關系。

1 材料與方法

1．1 研究對象 收集2007年11月到2008年9月經(jīng)我院病理確診的福爾馬林固定、石蠟包埋標本107例，術前均未放、化療，具有完整的臨床資料和病理資料。其中宮頸癌組46例，患者年齡33～64歲，中位年齡46歲。組織學分級(按WHO標準):Ⅰ/Ⅱ級31例，Ⅲ級15例;臨床分期［按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，1994)修訂的臨床分期標準分期］:Ⅰ期20例，≥Ⅱ期26例;局部腫瘤大小:＜4 cm者27例，≥4 cm者19例;間質浸潤程度:浸潤≤1/2肌層17例，浸潤 ＞1/2肌層29例;脈管和(或)宮旁浸潤:有浸潤25例，無浸潤21例;淋巴結轉移:有轉移13例，無轉移33例。CIN組43例，患者年齡31～58歲，中位年齡43歲，包括CINⅠ組21例，CINⅡ/Ⅲ組22例。對照組18例，為因良性病變行子宮全切的正常宮頸組織，患者年齡34～57歲，中位年齡44歲。三組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。全部標本均3～4μm厚連續(xù)切片，用于HE染色、免疫組化和原位雜交檢測，并得到高年資病理醫(yī)師再次確診證實。

1．2 試劑 cyclin G1(SC-8016)單克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司;PV-9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒等均購自北京中杉生物公司;cyclin G1 mRNA(MK1287-h)原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1．3 方法

1．3．1 原位雜交法檢測cyclin G1 mRNA的表達3%胃蛋白酶消化5分鐘，雜交液42℃雜交過夜，DAB顯色，其余原位雜交步驟嚴格按照試劑盒說明書。以PBS代替雜交液作陰性對照，用已知陽性結腸癌切片作陽性對照。結果判讀:cyclin G1 mRNA陽性染色為細胞漿呈棕褐色或棕黃色顆粒，胞核可有少量表達。400倍顯微鏡下每張載玻片計數(shù)1 000個細胞，根據(jù)陽性細胞所占百分比進行半定量分析:陽性細胞數(shù)＜5%為陰性，即“－”;陽性細胞數(shù)≥5%為陽性，其中5% ～25%為“+”，26% ～50%為“++”，＞50%為“+++”。

1．3．2 免疫組化二步法檢測cyclin G1蛋白的表達一抗(1∶50稀釋)4℃濕盒過夜，抗原高溫高壓進行修復，DAB顯色，其余免疫組化步驟嚴格按照試劑盒說明書。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性結腸癌切片作陽性對照。結果判讀:cyclin G1陽性染色為細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒，細胞結構清晰、陽性顆粒定位好、著色與背景對比清楚。陽性細胞所占百分比半定量分析與原位雜交法同。

1．4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法，表達強度的比較和相關性分析采用Spearman雙變量相關檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 不同級別宮頸病變組織cyclin G1 mRNA和蛋白的表達情況 cyclin G1 mRNA陽性表達主要定位于細胞質，cyclin G1蛋白陽性表達主要定位于細胞核，兩者陽性表達部位均與病變部位基本相符(圖分別見圖1和參考文獻1)。在正常對照組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組和宮頸癌組中，cyclin G1 mRNA和蛋白的陽性表達強度與宮頸病變級別均呈正相關，相關系數(shù)和 P值分別為 r=0．378，P=0．000;r=0．487，P=0．000。

圖1 原位雜交法檢測正常宮頸上皮、CIN和宮頸癌組織的cyclin G1 mRNA表達情況(×400)Fig．1 Expression of cyclin G1 m RNA in norm al cervix tissue，CIN and cervical carcinom a(ISH，DAB staining，×400)

表1 正常對照組、CIN組和宮頸癌組cyclin G1 mRNA和蛋白的表達(n=107)Tab．1 The expressions of cyclin G1 m RNA and cyclin G1 protein in normal cervix tissue，CIN and cervical carcinoma(n=107)

表2 正常對照組、CIN組和宮頸癌組cyclin G1 mRNA與cyclin G1蛋白表達的相關性(n=107)Tab．2 Relation of cyclin G1 protein expression with cyclin G1 m RNA expression in normal cervix tissue，CIN and cervical carcinoma(n=107)

表3 宮頸癌cyclin G1 mRNA、cyclin G1蛋白的表達與臨床病理因素的關系(%，n=46)Tab．3 Relations of cyclin G1m RNA expression and cyclin G1 protein expression with clinical pathologic characters in cervical carcinoma(%，n=46)

如表1結果所示，CIN組與宮頸癌組的cyclin G1 mRNA陽性表達率分別為46．5%和60．9%，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，但均顯著高于正常對照組(11．1%，P ＜0．05);CINⅡ/Ⅲ組的 cyclin G1 mRNA陽性表達率(45．5%)與 CINⅠ組(47．6%)的差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0．05)。

正常對照組、CIN組和宮頸癌組的cyclin G1蛋白陽性表達率分別為5．6%、51．2%和71．7%，呈遞增趨勢，且差異均有顯著性意義(P＜0．05);CINⅡ/Ⅲ組的cyclin G1蛋白陽性表達率(59．1%)與CINⅠ組(42．9%)比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

2．2 cyclin G1 mRNA與cyclin G1蛋白表達的相關性 在所檢測的107標本中，cyclin G1 mRNA陽性表達而cyclin G1蛋白陰性表達10例，cyclin G1mRNA陰性表達而cyclin G1蛋白陽性表達16例，兩者都陽性表達40例，兩者都陰性表達41例。經(jīng)Spearman等級相關分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著正相關，相關系數(shù)r=0．530，P=0．000。參見表2。進一步分析顯示，在正常對照組、CIN組和宮頸癌組中，cyclin G1蛋白與cyclin G1 mRNA的表達均呈顯著正相關，相關系數(shù)和P值分別為r=0．686，P=0．002;r=0．445，P=0．003 和 r=0．387，P=0．008。

2．3 宮頸癌cyclin G1mRNA、cyclin G1蛋白的表達與臨床病理因素的關系 如表3結果所示，宮頸癌組的cyclin G1 mRNA陽性表達率與淋巴結轉移、組織學分級、臨床分期、腫瘤大小、間質浸潤深度和有無脈管或宮旁浸潤等臨床病理因素均無明顯關系(P＞0．05)，但cyclin G1蛋白陽性表達率與淋巴結轉移有關(P ＜0．05)。

3 討論

Cyclin G是一類發(fā)現(xiàn)較晚的細胞周期蛋白，目前認為它的家族可能包括cyclin G1、cyclin G2、cyclin I三個亞型［2］。雖然cyclin G1和G2在序列上屬同系物，但它們可能各自有獨特的生理學作用［3］。cyclin G1 是 1993 年 Tamura 等［4］在鼠成纖維細胞中意外發(fā)現(xiàn)的，其確切功能至今還不明確。Skotzko等［5］發(fā)現(xiàn)在成骨肉瘤細胞中有cyclin G1的超表達和P53、RB抑癌基因的低表達，采用逆轉錄病毒載體將cyclin G1反義核酸導入成骨肉瘤中，可誘導瘤細胞的凋亡，這說明cyclin G1可能對成骨肉瘤的發(fā)生有促進作用。據(jù)現(xiàn)有資料顯示，cyclin G1的高表達還與多種消化道腫瘤、白血病等的發(fā)生有關［6，7］，但cyclin G1表達與宮頸癌關系的研究卻鮮有報道。梁靜等［8］用免疫組化技術檢測結果顯示，cyclin G1在正常宮頸組幾乎沒有表達，而在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌各組的陽性表達率和表達強度逐漸增加，并且在各級病變宮頸組織中的陽性著色區(qū)域和病變區(qū)域基本相符，并因此認為cyclin G1的過度表達提示宮頸細胞的增殖能力強，并與宮頸病變的發(fā)展呈正相關。

本實驗用免疫組化和原位雜交技術檢測結果顯示，CIN組與宮頸癌組的cyclin G1 mRNA和cyclin G1蛋白都有高表達，而且陽性表達部位與宮頸病變部位基本相符;CIN組與宮頸癌組的cyclin G1 mRNA陽性表達率均顯著高于正常對照組(P＜0．05)，尤其是cyclin G1蛋白在正常對照組、CIN組和宮頸癌組的陽性表達率呈逐漸增高趨勢(P＜0．05)。在正常對照組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組和宮頸癌組中，cyclin G1 mRNA和蛋白的陽性表達強度與宮頸病變級別均呈正相關(r分別為0．378和0．487)。這提示cyclin G1在宮頸癌的癌前病變中就已顯著升高，可能與宮頸病變的發(fā)展和宮頸癌的發(fā)生密切相關。這與本課題前期研究結果cyclin G1蛋白在正常對照組、CIN組和宮頸癌組的陽性表達率呈逐漸增高趨勢高度一致［1］，也與梁靜［8］的報道基本相符。

Shimizu 等［9］研究結果顯示，用 cyclin G1 mRNA反義互補的寡核苷酸可抑制cyclin G1蛋白的表達，并表明cyclin Gl可能與G2/M期檢測點的調控有關。本實驗結果顯示，cyclin G1蛋白與cyclin G1 mRNA的表達具有顯著正相關(r=0．530，P=0．000)，這說明cyclin G1蛋白的高表達可能是其mRNA轉錄水平增高所致，這種高表達可能會使宮頸癌細胞跨越G2/M期調控點，加速細胞周期進程，促進宮頸惡性細胞克隆的無限增殖。但本實驗也發(fā)現(xiàn)，有16例 cyclin G1蛋白陽性表達而cyclin G1 mRNA卻呈陰性表達，這可能是所采用的石蠟包埋標本會降解部分mRNA以及會影響核酸探針的穿透從而降低雜交信號，使cyclin G1 mRNA出現(xiàn)假陰性結果，而cyclin G1蛋白卻相對穩(wěn)定不容易降解。這也提示進一步的相關實驗最好采用新鮮標本冰凍切片。

本實驗結果還顯示，cyclin G1 mRNA的陽性表達率與腫瘤組織學分級、臨床分期、腫瘤大小、間質浸潤深度、有無脈管或宮旁浸潤和淋巴結轉移等臨床病理因素均無明顯關系(P＞0．05)，但cyclin G1蛋白的陽性表達率與淋巴結轉移有關(P＜0．05)。這說明cyclin G1對宮頸癌的作用機制復雜，可能涉及到更為復雜的分子生物學基礎，但也在一定程度上提示它與宮頸癌惡性侵襲有關，宮頸癌cyclin G1蛋白的高表達可能預示患者預后不良。

綜上所述，cyclin G1 mRNA和蛋白在宮頸癌中均有高表達，可能與宮頸癌的發(fā)生有關;cyclin G1蛋白的高表達可能是其mRNA轉錄水平增高所致，并可能與宮頸癌惡性侵襲有關。但宮頸癌的發(fā)病原因復雜，僅僅cyclin G1的過表達可能不足以引起多數(shù)宮頸細胞發(fā)生轉化，需要多種癌基因和抑癌基因間的相互調節(jié)，協(xié)同作用。因此，cyclin G1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中更多的作用機制及其分子生物學基礎還有待于進一步研究。

1 翁玉英，孫蓬明，林東紅et al．宮頸癌cyclin G1表達與HPV分子亞型感染的研究［J］．中國婦幼保健，2010;25(15):2118-2121．

2 Kimura SH，Nojima H．Cyclin G1 associates with MDM2 and regulates accumulation and degradation of p53 protein［J］．Genes Cells，2002;7(8):869-880．

3 Horne M C，Goolsby G L，Donaldson K L et al．Cyclin G1 and cyclin G2 comprise a new family of cyclins with contrasting tissue-specific and cell cycle-regulated expression［J］．J Biol Chem，1996;271(11):6050-6061．

4 Tamura K，Kanaoka Y，Jinno S et al．Cyclin G:a new mammalian cyclin with homology to fission yeast cigl［J］．Oncogene，1993;8(8):2113-2118．

5 Skotzko M，Wu L，Anderson W F etal．Retroviral vectormediated gene transfer of antisense Cyclin Gl(CYC Gl)inhibits proliferation of human osteogenic sarcoma cells［J］．Cancer Res，1995;55(23):5493-5498．

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7 Gramantieri L，F(xiàn)erracin M，F(xiàn)ornari F et al．Cyclin G1 is a target of miR-122a，a microRNA frequently down-regulated in human hepatocellular carcinoma［J］．Cancer Res，2007;67(13):6092-6099．

8 梁 靜，卞美璐，劉 霞．cyclin G1在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達［J］．中日友好醫(yī)院學報，2005;19(2):67-69，72．

9 Shimizu A，Nishida J，Ueoka Y etal．Cyclin G contributes to G2/M arrest of cells in response to DNA damage［J］．Biochem Biophys Res Commun，1998;242:529-533．