重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子脂質(zhì)體的制備及其物理穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

滕 躍，田海山，張 睿，焦 悅，李校堃

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子脂質(zhì)體的制備及其物理穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

滕 躍1，2，田海山1，3，張 睿1，焦 悅1，李校堃1，3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：確立重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFGF）脂質(zhì)體制備的最佳處方及工藝條件，研究其理化性質(zhì)。方法：采用凍干再水化法，以磷脂與膽固醇質(zhì)量之比、緩沖溶液pH值和均質(zhì)時(shí)間為單因素，每個(gè)因素選取三水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以藥物包封率、物理穩(wěn)定性和生物活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確立優(yōu)化脂質(zhì)體制備的最佳處方及工藝條件。結(jié)果：采用最佳處方工藝條件，即磷脂與膽固醇的比例為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為6.5，高壓均質(zhì)時(shí)間為20min制備的rhaFGF脂質(zhì)體，經(jīng)測(cè)定其包封率（En）達(dá)81.79%±2.51%，物理穩(wěn)定性參數(shù)（KE）為1.050%±0.342%，生物學(xué)活性為（6.521 0±0.617 1）×105U·mL－1，粒子大小較均勻，粒徑大多分布在100nm左右。結(jié)論：通過優(yōu)化工藝條件制備的rhaFGF脂質(zhì)體包封率高，在4℃保存條件下，滲漏率低且具有很好的物理穩(wěn)定性及生物學(xué)活性。

重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；脂質(zhì)體；包封率；滲漏率

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）是一個(gè)多肽類生長(zhǎng)因子家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)24個(gè)成員，重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（recombinant human acidic fibroblast growth factor，rhaFGF）為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員。作為一個(gè)高度保守的功能蛋白，rhaFGF不但具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、神經(jīng)組織修復(fù)以及胚胎發(fā)育與分化等方面的作用，而且還具有舒張血管、缺血保護(hù)、促血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、分化和遷移作用［1－2］。研究結(jié) 果［3－6］表 明：rhaFGF 在心臟缺血和冠心病中對(duì)新生血管形成過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，如毛細(xì)血管基底膜降解、膠原合成和小血管腔形成等均有明顯促進(jìn)作用，而冠心病的發(fā)生與上述因素的抑制和異常存在著密切的關(guān)系。rhaFGF作為一種蛋白類藥物與傳統(tǒng)的藥物相比具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優(yōu)點(diǎn)，但是其體內(nèi)外的不穩(wěn)定性以及蛋白類藥物半衰期短、清除率高，易受體內(nèi)酶和體液的破壞等因素限制了多肽、蛋白類藥物的應(yīng)用［7］。因此，找到一種安全、有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類藥物的給藥系統(tǒng)是目前生物技術(shù)藥物所面臨的一個(gè)重大難題。

脂質(zhì)體（liposome）是一種將藥物包封于類脂雙分子層中所形成的超微型球狀載體制劑，是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統(tǒng)。由Bangham于20世紀(jì)60年代中期提出，迄今已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、生物物理學(xué)等各種科學(xué)領(lǐng)域，并且脂質(zhì)體作為藥 物 傳 遞 系 統(tǒng) 已 廣 泛 應(yīng) 用 于 臨 床［8－10］。自Gregoriadis等利用脂質(zhì)體作為藥物載體以來，脂質(zhì)體作為一種新型的藥物載體的研究與應(yīng)用迅速發(fā)展，脂質(zhì)體載藥技術(shù)日趨成熟。因此本文作者確立了rhaFGF脂質(zhì)體制備的最佳處方及工藝條件，以期為冠心病的治療開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

rhaFGF原液（本實(shí)驗(yàn)室制備并保存）；德固賽大豆磷脂（SPC，德國嘉吉公司）；膽固醇（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；NIH 3T3細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存）；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

冷凍干燥機(jī)（VirTis公司）；低溫高速離心機(jī)（BECKMAN COULTER Avanti J－26XP）；掃描電子顯微鏡S－3400N（日本，日立公司）；激光粒度分析儀；KQ－250DB型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；ZFQ 85A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AH－100高壓均質(zhì)機(jī)（加拿大，ATS公司）；S20K pH指示劑（德國，梅特勒公司）；PLUS384酶標(biāo)儀（美國，美國分子生物公司）；Waters型高效液相色譜儀（美國，Waters公司）；色譜柱DiamonsiTM （鉆 石）C18，5 μm，250mm×4.6mm（Dikma公司）。

1.3 rhaFGF脂質(zhì)體的制備及鑒定

1.3.1 rhaFGF脂質(zhì)體的制備 用凍干再水化法制備脂質(zhì)體（FRV）。精密稱取大豆卵磷脂1.00g與膽固醇0.05g，溶于50mL三氯甲烷中，超聲震蕩10min后，加入75mL乙醚與25mL三氯甲烷（此過程處于超聲震源處并需防止水濺入，注意封口防止揮發(fā)），滴加0.02mol·L－1、pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液50mL，超聲至不分層，形成乳白色油包水化體后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)過程中相變，變成水包油，即得脂質(zhì)體。隨后在1 200～1 500bar條件下高壓均質(zhì)15～30min，依次采用1.00、0.60、0.45、0.22 μm 濾 膜 進(jìn) 行 整 粒， 加 入rhaFGF于37℃孵育15min后加入附形劑混合分裝，－40℃預(yù)凍2h，冷凍干燥24h后4℃、25℃、37℃保存，使用時(shí)加注射用水水化即得rhaFGF脂質(zhì)體。

1.3.2 SDS－PAGE電泳－銀染法對(duì)rhaFGF脂質(zhì)體進(jìn)行鑒定 精密吸取rhaFGF脂質(zhì)體樣品100μL，加入過量的NaCl，振搖后，加入氯仿300μL振搖混合均勻，8 000r·min－1離心分離10min，取上清液，PB（pH6.5）稀釋10倍，加入相同體積的上樣緩沖液，沸水浴加熱10min，12 000r·min－1離心分離10min。用微量進(jìn)樣器吸取20μL上樣，同時(shí)加蛋白Marker、空白脂質(zhì)體和rhaFGF原液作為對(duì)照。

1.3.3 脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化 通過單因素考察對(duì)脂質(zhì)體處方進(jìn)行優(yōu)化，A：磷脂與膽固醇質(zhì)量之比；B：磷酸鹽緩沖溶液pH值；C：高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)時(shí)間。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)預(yù)試，選取影響包封率因素，每個(gè)因素選取三水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以藥物包封率、物理穩(wěn)定性和生物活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.4 脂質(zhì)體的評(píng)價(jià)方法

1.4.1 形態(tài)學(xué)及粒徑分布 采用掃描電鏡對(duì)rhaFGF脂質(zhì)體樣品形態(tài)學(xué)觀察。取rhaFGF脂質(zhì)體樣品滴加于樣品臺(tái)上，干燥完全后抽真空達(dá)4Pa，調(diào)節(jié)放電電壓（1 200～1 400V），電流5～6mA進(jìn)行鍍膜，厚度約10nm。將樣品放入掃描電鏡中，抽真空為5×10－3Pa，調(diào)節(jié)電鏡的加速電壓、工作電流及工作距離，對(duì)樣品進(jìn)行觀察。先在低放大倍數(shù)下對(duì)電鏡進(jìn)行粗略的聚焦，然后調(diào)整樣品位置，調(diào)高放大倍數(shù)直到樣品形態(tài)清晰，迅速聚焦并照相。采用激光散射法進(jìn)行脂質(zhì)體粒度的分析。首先用蒸餾水將激光粒度分析儀調(diào)零調(diào)平后，使用微量進(jìn)樣器取10mL rhaFGF脂質(zhì)體樣品緩慢加入到進(jìn)樣口中，等待激光粒度分析儀檢測(cè)粒徑大小及粒度分布情況并制圖。

1.4.2 包封率（En）的測(cè)定 取2mL rhaFGF脂質(zhì)體樣品置于10mL定量瓶中，用二甲亞砜定溶，再以95%乙醇稀釋10倍，搖勻，用HPLC定量。按下式計(jì)算包封率：En（%）＝（We／Wt）×100%，其中We和Wt分別代表被包封入脂質(zhì)體中的rhaFGF量和總rhaFGF量。

1.4.3 穩(wěn)定性的測(cè)定 采用離心－分光光度法測(cè)定物理穩(wěn)定性參數(shù)（KE），精密吸取rhaFGF脂質(zhì)體樣品1mL，置離心管中3 200r·min－1離心10min，取離心前的脂質(zhì)體及離心后的上清液各0.3mL，分 別 加 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （pH 6.5，0.02mol·L－1）稀釋至5.0mL，以磷酸鹽緩沖液為空白，于波長(zhǎng)280nm處測(cè)定吸光度（脂質(zhì)體離心前后測(cè)得的吸光度值分別為A0和A），計(jì)算物理穩(wěn)定性參數(shù)KE值。KE＝（A0－A）／A0×100%，KE值越小，說明脂質(zhì)體越穩(wěn)定。

1.4.4 脂質(zhì)體滲漏率測(cè)定 采用SephadeX G－50分子排阻色譜法將載藥脂質(zhì)體與游離藥物分開，再將載藥脂質(zhì)體混懸液分別置于4℃、25℃、37℃保存，間隔一定的時(shí)間用HPLC方法測(cè)定藥物滲漏率（Q滲）。Q滲（%）＝（放置前介質(zhì)中的藥物量－放置后介質(zhì)中的藥量）／制劑中藥量×100%。

1.4.5 生物活性的測(cè)定 采用 MTT法測(cè)定［11］rhaFGF脂質(zhì)體和rhaFGF原液。用含0.5%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至0.1mg·L－1，精密吸取100μL加入第1孔，依次4倍稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)復(fù)孔；rhaFGF標(biāo)準(zhǔn)品初始計(jì)量為100U，并設(shè)空白脂質(zhì)體基質(zhì)對(duì)照，在酶標(biāo)儀上以630nm為參比波長(zhǎng)，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定A值，計(jì)算rhaFGF脂質(zhì)體的生物學(xué)活性。

2 結(jié) 果

2.1 rhaFGF脂質(zhì)體鑒定

采用SDS－PAGE電泳－銀染法對(duì)rhaFGF脂質(zhì)體進(jìn)行鑒定，空白脂質(zhì)體泳道中未見rhaFGF條帶，rhaFGF脂質(zhì)體泳道中在與rhaFGF原液的泳道的相同位置有相應(yīng)的條帶。見圖1。

圖1 SDS－PAGE法測(cè)定rhaFGF脂質(zhì)體Fig.1 rhaFGF liposomes measured by SDS－PAGE

2.2 處方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以En、KE和生物活性為指標(biāo)，采用單因素考察方法運(yùn)用凍干再水化法制備的rhaFGF脂質(zhì)體樣品。以最佳處方工藝條件：即磷脂與膽固醇的比例為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為6.5，高壓均質(zhì)時(shí)間為20min制備的rhaFGF脂質(zhì)體，經(jīng)測(cè)定其En達(dá) （81.79 ± 2.51）%， KE為 （1.05 ±0.342）%，生物活性效價(jià)為 （6.521±0.617）×105U·mL－1。見表1～3。

2.3 rhaFGF脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)及粒徑分布

掃描電鏡觀察：rhaFGF脂質(zhì)體形狀較規(guī)則，呈現(xiàn)圓球形或橢圓球形囊泡；粒子大小較均勻，粒徑范圍約在100nm （圖2）。

表1 不同磷酸和膽固醇比例組脂質(zhì)體En、KE和生物活性的變化Tab.1 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in phospholipid and cholesterol with different ratios groups （n＝4，±s）

表1 不同磷酸和膽固醇比例組脂質(zhì)體En、KE和生物活性的變化Tab.1 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in phospholipid and cholesterol with different ratios groups （n＝4，±s）

SPC∶Chol En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）10∶1 65.81±4.51 0.88±0.35 6.52±0.69 20∶1 80.79±3.66 0.96±0.67 7.02±0.80 30∶1 78.90±1.93 1.00±0.24 7.24±0.17

表2 不同pH值組脂質(zhì)體En、KE和生物活性的變化Tab.2 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different PH values groups （n＝4，±s）

表2 不同pH值組脂質(zhì)體En、KE和生物活性的變化Tab.2 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different PH values groups （n＝4，±s）

pH En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）6.0 70.66±8.51 0.97±0.30 6.52±0.69 6.5 78.79±4.73 0.94±0.61 7.56±0.21 7.0 79.24±4.97 1.04±0.69 6.02±0.58

表3 不同粒徑分布組脂質(zhì)體En、KE和生物活性的變化Tab.3 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different particle size distribution groups（n＝4，±s）

表3 不同粒徑分布組脂質(zhì)體En、KE和生物活性的變化Tab.3 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different particle size distribution groups（n＝4，±s）

Time（t／min） En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）15 75.81±4.51 0.99±0.29 6.82±0.25 20 82.41±3.27 0.88±0.26 7.92±0.89 30 82.90±6.39 0.83±0.79 4.24±0.93

圖2 rhaFGF脂質(zhì)體掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.2 The observation results of rhaFGF liposome by scanning electron microscope

2.4 穩(wěn)定性考察

分別測(cè)定rhaFGF脂質(zhì)體在4℃、25℃和37℃條件下保存30d后的En、KE、Q滲及生物活性的變化情況。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)制備的rhaFGF脂質(zhì)體在4℃條件下較為穩(wěn)定，En、KE及生物學(xué)活性變化不大，而在25℃和37℃條件下不易穩(wěn)定存在。見表4。

圖3 rhaFGF脂質(zhì)體平均粒徑分布Fig.3 Average particle size distribution of rhaFGF liposome

2.5 生物活性的測(cè)定

采用MTT法測(cè)定rhaFGF脂質(zhì)體的生物活性，結(jié)果見圖4。由圖中可見：rhaFGF脂質(zhì)體樣品對(duì)NIH 3T3細(xì)胞有促增殖作用，且與aFGF標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性基本一致。

表4 不同溫度下脂質(zhì)體En、KE、Q滲和生物活性的變化Tab.4 Changes of En，KE，Q，and bioactivity of rhaFGF liposomes at different temperatures （n＝4，±s）

表4 不同溫度下脂質(zhì)體En、KE、Q滲和生物活性的變化Tab.4 Changes of En，KE，Q，and bioactivity of rhaFGF liposomes at different temperatures （n＝4，±s）

“－”：No data.

T（θ／℃） En（η／%） KE（η／%） Q（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）4 71.16±0.97 2.87±0.08 8.2±1.2 7.92±0.89 25 61.84±0.53 9.98±0.36 20.8±3.1 6.93±0.88 37 45.58±1.89 21.58±0.75 35.6±4.6—

圖4 各組NIH 3T3細(xì)胞生物活性的變化Fig.4 Changes of bioactivities of NIH 3T3cells in various groups

3 討 論

多肽、蛋白類藥物大多為內(nèi)源性物質(zhì)，這些活性蛋白在體內(nèi)含量極微，但參與和調(diào)控許多重要的生理學(xué)功能，針對(duì)性強(qiáng)、效果顯著，特別是在治療和預(yù)防嚴(yán)重威脅生命的疾病方面發(fā)揮愈來愈重要的作用。但這些物質(zhì)一般穩(wěn)定性較差，易在酸堿環(huán)境中被破壞或在體內(nèi)酶解。另外，此類藥物在體內(nèi)生物半衰期短，給藥后在血中消除很快，難以充分發(fā)揮其應(yīng)有的藥理作用［11－12］。

脂質(zhì)體作為一種新型的藥物傳遞系統(tǒng)，具有以下優(yōu)勢(shì)：①增強(qiáng)多肽、蛋白類藥物體內(nèi)外的穩(wěn)定性的作用；②包裹多肽、蛋白類藥物在體內(nèi)延緩釋放，可延長(zhǎng)藥物的半衰期；③用于多肽、蛋白類藥物的載體，可以實(shí)現(xiàn)藥物的靶向給藥；④局部運(yùn)用可增加藥物與局部組織的親和性，減少刺激［13］。這些優(yōu)點(diǎn)為多肽、蛋白質(zhì)類藥物應(yīng)用，尤其在穩(wěn)定性、延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期及靶向給藥領(lǐng)域發(fā)揮著越來越大的作用，有著廣闊的應(yīng)用前景。做為新型藥物載體，隨著在材料、制備方法、制備工藝、給藥途徑等方面逐步走向完善，為該類藥物制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化工藝條件制備的rhaFGF脂質(zhì)體包封率較高，且具有很好的物理穩(wěn)定性及生物學(xué)活性。本課題組將在本次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究rhaFGF脂質(zhì)體注射體內(nèi)后，其穩(wěn)定性、半衰期及藥物釋放度，并進(jìn)一步研究其對(duì)心肌缺血性冠心病的治療效果。

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Preparation of rhaFGF liposomes and evaluation of their physical stability

TENG Yue1，2，TIAN Hai－shan1，3，ZHANG Rui1，JIAO Yue1，LI Xiao－kun1，3
（1.Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China）

Objective To optimize the prescription and preparation of recombinant human acidic fibroblast growth factor（rhaFGF）liposomes，and to study the physical and chemical properties.Methods The encapsulation efficiency and biological activity of rhaFGF liposomes were evaluated by single factor test.Freeze－drying－rehydration was used to obtain the optimum prescription and preparation of rhaFGF liposomes.Results The encapsulation efficiency of rhaFGF liposomes was（81.79±2.51）%，the physical stability index（KE）was（1.050±0.342）%and the bioactivity was（6.521 0±0.617 1）×105U·mL－1.The particle size was about 100nm uniformly.Conclusion The preparation of rhaFGF liposomes is optimized，and these liposomes have high encapsulation efficiency，good physical stability and high bioactivity at 4℃.

recombinant human acidic fibroblast growth factor；liposome；encapsulation efficiency；percolation ratio

R94

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0932－05

2012－04－24

吉林省教育廳科研基金資助課題 ［2009（65）］

滕 躍 （1985－），女，內(nèi)蒙古自治區(qū)突泉縣人，在讀生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士，主要從事基因工程制藥的研究。

田海山 （Tel：0577－86689983，E－mail：tianhaishan332＠sina.com）；李校堃 （Tel：0431－84533348，E－mail：xiaokunli＠163.net）