阿魏酸鈉干預(yù)對(duì)Rho／Rock信號(hào)通路的影響及其對(duì)肝臟的保護(hù)作用

李 鳳，高海成，盛曉彤，孫文藝，陳園園，楊秀娜，陳金彤，蔣 博，國(guó)中華，孫 波

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林省通化四環(huán)有限公司，吉林 通化 134000）

阿魏酸鈉干預(yù)對(duì)Rho／Rock信號(hào)通路的影響及其對(duì)肝臟的保護(hù)作用

李 鳳1，高海成2，盛曉彤2，孫文藝2，陳園園2，楊秀娜2，陳金彤2，蔣 博2，國(guó)中華3，孫 波2

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林省通化四環(huán)有限公司，吉林 通化 134000）

目的：探討阿魏酸鈉（SF）干預(yù)后對(duì)Rho／Rock信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及肝臟的影響，闡明其對(duì)臟器的保護(hù)作用。方法：雄性Wistar大鼠20只，分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組及SF干預(yù)組。除正常對(duì)照組外，其余組大鼠注射鹽酸異丙腎上腺素（Iso）15mg·kg－1誘發(fā)大鼠心肌纖維化模型；穩(wěn)定2d后，除模型組外，其余2組給予SF和貝那普利。利用Masson染色分析給予SF后心肌膠原的含量變化；RT－PCR法分析Rho A和Rock mRNA表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)染色分析心肌Rock蛋白表達(dá)；拉曼光譜分析肝臟的損傷。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，注射Iso后3周，Rho A和Rock mRNA表達(dá)即有所增加 （P＜0.01）；給予SF和貝那普利后，Rho A和Rock基因和蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低（P＜0.01）；拉曼光譜分析結(jié)果顯示，給予SF后大鼠肝臟組織的峰位較模型組向右移動(dòng)1個(gè)單位，趨近正常對(duì)照組峰位。結(jié)論：SF可能通過(guò)阻斷Rho／Rock信號(hào)通路進(jìn)而起到抑制纖維化的作用，同時(shí)又起到肝臟保護(hù)作用。

心肌纖維化；阿魏酸鈉；Rho／Rock通路

隨著人口的老齡化，心血管類疾病已變?yōu)閲?yán)重威脅人類健康的重要疾病。然而多種心血管疾病，如心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、高血壓心臟病、糖尿病性心肌病變、心肌病以及心肌炎等等，均伴有心肌重構(gòu)的過(guò)程，而心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心肌重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)［1－2］。在臨床上具有重要的意義，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Rho／Rock信號(hào)通路介導(dǎo)多種功能異常的疾病，是近年的研究熱點(diǎn)之一［3］，其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的聚合狀態(tài)，參與多種疾病的生物學(xué)過(guò)程，如動(dòng)脈粥樣硬化、MF等［4］。阿魏酸鈉（sodium ferulate，SF）是阿魏酸鈉鹽，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化等藥理學(xué)作用，目前研究最多的是其抗氧化和內(nèi)皮素受體拮抗作用［5－7］。然而，有關(guān)SF對(duì)心肌的保護(hù)作用及其對(duì)Rho／Rock信號(hào)通路的影響，迄今國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究將為臨床防治MF具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鹽酸異丙腎上腺素（Iso）由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)；小鼠抗大鼠RockⅠ單克隆抗體及SP－9000免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒，由北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司提供；徠卡4215切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司）；Olympus PM－10AO全自動(dòng)顯微照相裝置（日本，日本島津公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性 Wistar大鼠20只，體質(zhì)量180～220g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（吉）2007－0012］。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、Iso組（3周組）、貝那普利陽(yáng)性對(duì)照組（Bena組）和阿魏酸鈉組（SF組），每組5只。Iso組大鼠采用多點(diǎn)皮下一次性注射15mg·kg－1的Iso誘發(fā)MF；正常對(duì)照組注射15mg·kg－1的生理鹽水。自造模穩(wěn)定2d后，SF組除注射Iso外，腹腔注射110mg·kg－1SF，每日1次；Bena組大鼠除注射Iso外，15mg·kg－1Bena混懸液灌胃，每日1次。3周后，脫臼處死大鼠。

1.3 病理標(biāo)本的獲取 處死大鼠，經(jīng)10%甲醛固定30min；常規(guī)石蠟包埋。用二甲苯脫蠟10min，用100%～75%乙醇置換二甲苯。經(jīng)蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色。

1.4 Rock免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2去離子水（無(wú)色液體）孵育5～10min。滴加試劑A液室溫孵育10～15min，傾去，勿洗。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。PBS沖洗，3min×3次。滴加試劑B液，室溫或37℃孵育10～15min。PBS沖洗，3min×3次。滴加試劑C液，室溫孵育10～15min。PBS沖洗，3min×3次。DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。1.5 免疫組織化學(xué)圖像分析 于每張切片左心室尖部，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)所選視野內(nèi)的陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)的平均吸光度（A）值。

1.6 半定量RT－PCR 取新鮮凍存心臟組織，按Trizol試劑盒提供方法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH內(nèi)參基因上游引物：5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′，下 游 引 物：5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′；Rock上游引物：5′－GGTGATGGCTATTATGGACG－3′，下游引物：5′－GTGTCTCGGAGCGTTTCC－3′；Rho A上 游 引 物：5′－GATGGAGCTTGTGGTAAGA－3′，下 游 引 物：5′－AAACTATCAGGGCTGTCG－3′。退火溫度55℃，循環(huán)35次，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為452、302和239bp。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，以GAPDH光密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，Rock和Rho A mRNA表達(dá)量以Rock和Rho A與GAPDH A值之比表示。

1.7 拉曼光譜法測(cè)定肝臟組織的吸收 利用生理鹽水勻漿各組肝臟組織，去除上清，剩余固體樣本進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定范圍為1 200～1 800cm2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，Rock和Rho A的基因和蛋白表達(dá)量以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Masson染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠心肌間質(zhì)僅見少量膠原，其整個(gè)視野的含量是17.1±2.4；而模型組在3周時(shí)膠原含量明顯增加（48.6±4.5），其膠原含量明顯高于正常組（P＜0.01）；給予SF和Bena后，其膠原含量（34.5±3.1，24.2±1.6）較模型組明顯降低（P＜0.01）（圖1）。

圖1 各組大鼠心肌組織中膠原含量的變化（Masson染色，×400）Fig.1 The changes of collagen content in rat myocardium tissues in various groups（Masson staining，×400）

2.2 各組大鼠心肌組織中Rock蛋白的表達(dá)量

正常對(duì)照組大鼠心肌間質(zhì)可見極少量、呈黃褐色的微弱陽(yáng)性表達(dá)，在成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，Rock的表達(dá)量是5.8±1.7。注射3周后，模型組大鼠心肌組織中Rock陽(yáng)性表達(dá)量（25.9±2.0）較正常對(duì)照組增加 （P＜0.01）。而在Bena組與SF治療組中Rock陽(yáng)性表達(dá)量（18.5±1.4，19.9±1.5）較 模 型 組 明 顯 降 低（P＜0.01）（圖2）。

圖2 各組大鼠心肌組織中Rock蛋白的表達(dá)（RockⅠ染色，×400）Fig.2 Expressions of Rock protein in rat myocardium tissues in various groups（RockⅠstaining，×400）

2.3 各組大鼠心肌組織中Rho A和Rock mRNA表達(dá)量 正常對(duì)照組的基因表達(dá)較少，其灰度值分別是 （Rho A）0.13±0.01和 （Rock I）0.31±0.03；注射Iso后3周，Rho A和Rock mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，其含量分別為0.48±0.05和0.62±0.02 （P＜0.01）；而Bena和SF組Rho A和Rock mRNA表達(dá)較模型組降低，其灰度值是 （Bena）0.39±0.08、0.47±0.03和 （SF）0.21±0.01、0.42±0.02（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織中Rho A和Rock mRNA的表達(dá)Fig.3 Expressions of Rho A and Rock mRNA in myocardium tissue in various groups

2.4 阿魏酸鈉對(duì)大鼠肝臟的影響 正常大鼠肝臟組織在1 447～1 594cm3有較明顯的吸收峰位，其峰值是1 447cm3；而注射Iso誘發(fā)MF后的肝臟組織其峰值向左移動(dòng)2個(gè)單位即1 449cm3；給予阿魏酸鈉和貝那普利后拉曼光譜值相對(duì)于模型組即向右有所回落。見圖4。

圖4 肝組織的拉曼吸收光譜Fig.4 Raman spectrum of liver tissue

3 討 論

SF是從當(dāng)歸、川芎類植物中獲得的有效成分，有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化等作用，是作為治療冠心病的理想藥物之一［8－11］。目前，研究最多的是其抗氧化作用和內(nèi)皮素受體拮抗作用，其可通過(guò)干預(yù)內(nèi)皮素和氧自由基等機(jī)制保護(hù)臟器［7］。然而，有關(guān)SF是否通過(guò)阻斷Rho／Rock通路進(jìn)而對(duì)心肌纖維化起到治療作用以及其對(duì)其他臟器的保護(hù)作用，迄今國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、RT－PCR及拉曼光譜等方法，系統(tǒng)研究了SF干預(yù)下Rho／Rock通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及肝臟的影響，進(jìn)而觀察SF干預(yù)大鼠MF后對(duì)臟器的影響。

Rho／Rock信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子包括Rho GTP酶、Rock和肌球蛋白磷酸酶。Rho是Ras超家族中的小GTP蛋白，與基質(zhì)細(xì)胞間黏附及細(xì)胞收縮等有關(guān)。Rho接受上游信號(hào)刺激后，從無(wú)活性的GDP結(jié)合形式轉(zhuǎn)變成GTP結(jié)合的活性形式。而Rock是Rho下游的主要靶分子，接受Rho傳遞的活化信號(hào)后，通過(guò)多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化而激活，可介導(dǎo)其下游的磷酸化／脫磷酸化反應(yīng)，可控制細(xì)胞的多種生物學(xué)行為［12］。Rho／Rock信號(hào)通路可在纖維化動(dòng)物模型體內(nèi)異常表達(dá)和活化；而在該通路抑制劑的干預(yù)下，可不同程度阻止和改善相應(yīng)臟器的纖維化程度。因此認(rèn)為Rho／Rock通路參與了纖維化的發(fā)生［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組Rho A及Rock的蛋白和基因表達(dá)均明顯增加；而給予貝那普利和SF后，RhoA和Rock的基因和蛋白表達(dá)均有所降低；同時(shí)拉曼光譜結(jié)果亦顯示：SF有保護(hù)肝臟的作用。因此，本文作者推測(cè)SF可改善MF大鼠的生存率，延緩和減輕 MF，抑制Rho／Rock通路進(jìn)而起到抗纖維化的作用，同時(shí)亦可降低肝臟的損傷，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of sodium ferulate on Rho／Rock signal pathway and its protective effect on liver tissue

LI Feng1，GAO Hai－cheng2，SHENG Xiao－tong2，SUN Wen－yi2，CHEN Yuan－yuan2，YANG Xiu－na2，CHEN Jin－tong2，JIANG Bo2，GUO Zhong－h(huán)ua3，SUN Bo2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China；2.Department of Experimental Pharmacology and Toxicology，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Victoria Limited Company，Tonghua City，Tonghua 134000，China）

Objective To investigate the effect of the expression of sodium ferulate（SF）on the related protein of Rho／Rock signal pathway and to clarify the protective effects on liver tissue and myocardium tissue.Methods Twenty male Wistar rats were divided into normal control group，model group，positive medicine group，and sodium ferulic group.Besides normal control group，the rats in the other groups were injected with 15mg·kg－1Iso to induce rat myocardial fibrosis.2dlater，except control and model groups，the rats in the other groups were given SF and Bena zepril.The change of collagen content in myocardium was analyzed by Masson staining.The expressions of Rho A and Rock mRNA were analyzed by RT－PCR.The expression of Rock protein was analyzed by immunohistochemistry.The Raman spectrum was used to detect the liver tissue injury.Results Compared with control group，the expressions of RhoA and Rock mRNA were increased after injection with Iso for 3weeks（P＜0.01）；compared with model group，the expressions of Rho A and Rock mRNA and protein were decreased after injection with SF（P＜0.01）.The Raman spectrum results showed that the peak value in SF group shifted to the right with one unit compared with model group，and tended to normal control group.Conclusion SF can not only protect the heart against fibrosis by inhibiting Rho／Rock pathway，but also can protect liver damage.

myocardial fibrosis；sodium ferulate；Rho／Rock pathway

R965

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0889－05

2012－07－06

吉林省科技廳科研基金資助課題 （201101067）；廣東省廣州市天普項(xiàng)目基金資助課題 （2012099）；吉林大學(xué)基本業(yè)務(wù)費(fèi)資助課題 （2012）

李 鳳 （1965－），女，吉林省白城市人，主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事婦產(chǎn)科及心血管學(xué)的研究。

孫 波 （Tel：0431－85619702，E－mail：sunbo＠jlu.edu.cn）

時(shí)間：2012－08－31 10：55

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20120831.1055.004.html