持續(xù)高劑量電磁輻射對(duì)小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量影響的長(zhǎng)期效應(yīng)

張怡堃，李 慧，黃根山，董 波，蘇振濤

（1.第二炮兵總醫(yī)院血液科，北京 100088；2.總裝司令部黃寺門(mén)診部，北京 100021；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

持續(xù)高劑量電磁輻射對(duì)小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量影響的長(zhǎng)期效應(yīng)

張怡堃1，李 慧1，黃根山2，董 波3，蘇振濤3

（1.第二炮兵總醫(yī)院血液科，北京 100088；2.總裝司令部黃寺門(mén)診部，北京 100021；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

目的：觀察慢性持續(xù)高劑量電磁輻射照射后小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量及比例變化，探討慢性持續(xù)高劑量電磁輻射對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響。方法：采用隨機(jī)、平行對(duì)照分組法，將30只雄性Balb／c小鼠平均分為正常對(duì)照組、10mW·cm－2輻照組及環(huán)磷酰胺給藥組，每組10只。輻照組動(dòng)物予以30min·d－1、每周輻照5d，持續(xù)4周；給藥組在輻照組開(kāi)始輻照時(shí)給藥，每次每只30mg·kg－1，共7次；各組小鼠于輻照結(jié)束后30、45、60、75、90、105和120d分別采集尾靜脈血，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD4＋／CD8＋比率、CD49＋NK細(xì)胞數(shù)量及比例的變化。結(jié)果：經(jīng)持續(xù)高劑量電磁輻射后，小鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)量顯著上升，CD4＋T細(xì)胞數(shù)量于輻照后75d開(kāi)始明顯升高，輻照后90d開(kāi)始下降但仍高于正常組（P＜0.05），觀察周期結(jié)束時(shí)，CD4＋T細(xì)胞數(shù)量下降到與正常組相同（120d）；CD8＋T細(xì)胞數(shù)量于輻照后75d明顯降低，直到觀察周期結(jié)束時(shí)（120d），T細(xì)胞的數(shù)量恢復(fù)至與正常組的T細(xì)胞數(shù)量相同；CD4＋／CD8＋比率在持續(xù)高劑量電磁輻射誘導(dǎo)下呈上升趨勢(shì)，并且明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；CD49＋NK細(xì)胞數(shù)量在輻射后明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：慢性、持續(xù)性大劑量電磁輻射可導(dǎo)致小鼠免疫系統(tǒng)的紊亂，通過(guò)檢測(cè)外周血中CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD4＋／CD8＋T細(xì)胞、CD49＋NK細(xì)胞數(shù)量及比例的變化，可了解輻照后機(jī)體的免疫狀態(tài)。

電磁輻射；免疫細(xì)胞；小鼠，近交BALB／C

電磁污染已成為新的環(huán)境污染因素，其對(duì)人群的健康威脅日益凸顯［1－2］。近來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道：在電磁輻射超出衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的作業(yè)環(huán)境中的人群，發(fā)生神經(jīng)癥狀、行為能力下降、免疫功能減弱和血液細(xì)胞突變的幾率增加，提示應(yīng)當(dāng)重視該人群的健康追蹤研究［3－4］。高劑量電磁輻射對(duì)生物的損傷效應(yīng)的研究取得了一定的進(jìn)展［5－6］。但是電磁輻射對(duì)人體淋巴細(xì)胞免疫活性的影響及進(jìn)而產(chǎn)生的遠(yuǎn)期效應(yīng)尚無(wú)定論［7－8］。因此，本研究擬建立高劑量電磁輻射的動(dòng)物研究模型，通過(guò)檢測(cè)輻照后小鼠外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量及比例的變化，初步探討電磁輻射對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷以及損傷程度與輻照劑量之間的關(guān)系，為深入研究電磁輻射的生物效應(yīng)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 輻射源由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，流式細(xì)胞儀 （BD pharmingen公司，美國(guó)），MEK－7222K全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 （日本光電工業(yè)株式會(huì)社，日本），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus賀力氏），臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。肝素、FITC antimouse CD3ε抗體、APC anti－mouse CD8a抗體、PE anti－mouse CD4抗體和 PE anti－mouse CD49b抗體（BioLegend公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只雄性Balb／c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng) 物 實(shí) 驗(yàn) 中 心 提 供 ［BASK－（軍 ）（2007－004）］，30只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺（CTX）及輻照組共3組，每組10只。

1.3 照射及給藥處理 小鼠供試前在清潔動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物基本狀態(tài)良好即開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。輻照組小鼠接受照射，照射劑量10mW·cm－2，每天照射30min，連續(xù)4周；給藥組小鼠，每次每只給予CTX 30mg·kg－1，共7次；正常對(duì)照組放置于電磁輻射室外未接受照射。

1.4 小鼠外周血象白細(xì)胞的檢測(cè) 將小鼠固定于小鼠固定器，在尾靜脈的中下1／3尾靜脈，采50μL靜脈血置于已抗凝的 （EDTA－K2）的EP管中，混勻，吸出20μL加到2mL稀釋液中，加入對(duì)應(yīng)的熒光抗體，在室溫下避光孵育15min，加500μL紅細(xì)胞溶解素，室溫避光孵育10min，1 500r·min－1離心5min，棄上清，加1mL PBS洗細(xì)胞重懸細(xì)胞，1 500r·min－1離心5min，棄上清，加300μL 0.5%多聚甲醛的PBS重懸細(xì)胞，混勻后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白細(xì)胞的總數(shù)。

1.5 小鼠外周血免疫細(xì)胞的檢測(cè) 取小鼠外周血約500μL置于肝素抗凝的EP管中。依據(jù)外周血WBC計(jì)數(shù)，按照抗體所需標(biāo)準(zhǔn)量分別加入anti－mouse CD4抗體0.625μL、anti－mouse CD8抗體0.625μL，常溫避光，孵育30min。按比例加入紅細(xì)胞裂解液NH4Cl－NaHCO3液，振蕩混勻，常溫避光，孵育15min，溶血。加PBS終止溶血，離心，1 700r·min－1×5min，棄上清，后再用PBS洗滌細(xì)胞2遍，1 700r·min－1×5min，離心，棄上清，用250μL PBS重懸細(xì)胞，加入250μL 4%多聚甲醛混勻后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，檢測(cè)CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算CD4＋／CD8＋比例。

1.6 觀察指標(biāo) 各實(shí)驗(yàn)組均于照射后30、45、60、75、90、105和120d于尾靜脈的中下1／3處采靜脈血，取10μL抗凝血至1.5mL EP管中，加入10μL 1∶50倍稀釋大鼠血清10μL，封閉Fc受體，加入1∶300稀釋的anti－CD49單抗（1mg·L－1）10μL，避 光 標(biāo) 記 15min，加 入FACS專(zhuān)用裂解液200μL，充分混勻，避光室溫作用5min應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD49＋。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Chiss 2005統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD4＋T 細(xì)胞、CD8＋T 細(xì)胞、CD4＋／CD8＋比率等指標(biāo)以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 電磁輻射對(duì)小鼠體溫的影響 為排除電磁輻射的熱效應(yīng)而檢測(cè)其生物效應(yīng)，于輻照前后檢測(cè)小鼠肛溫的變化，對(duì)于肛溫變化≤1℃的小鼠進(jìn)行生物效應(yīng)的檢測(cè)。照射組10只小鼠肛溫度變化均小于1℃。

2.2 持續(xù)高劑量電磁輻射作用下小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)的變化 慢性持續(xù)高劑量的電磁輻射后，與正常對(duì)照組及環(huán)磷酰胺組比較，輻照組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)的變化Tab.1 Changes of the number of white blood cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

表1 各組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)的變化Tab.1 Changes of the number of white blood cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with CTX group.

25.61±6.69 28.59±7.17 CTX 15.07±2.65 13.13±3.30＊ 10.43±3.07 19.91±6.32 7.58±1.29 20.04±5.06＊ 25.82±4.67 Irradiation 5.84±3.35＊＊ 13.44±2.60＊ 10.81±3.29 13.50±2.49△ 4.54±1.46△ 14.78±3.14＊＊30 45 60 75 90 105 120 Control 14.00±2.84 17.68±2.31 10.26±2.00 16.48±5.00 4.30±0.97△Group No.of white blood cells（t／d）24.84±5.21

2.3 持續(xù)高劑量電磁輻射誘導(dǎo)小鼠外周血CD4＋T細(xì)胞數(shù)量的變化 電磁輻射后，與正常對(duì)照組比較，照射組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4＋T細(xì)胞數(shù)量均明顯升高；與環(huán)磷酰組比較，在照射后75d及105dCD4＋T細(xì)胞數(shù)量升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4＋T細(xì)胞數(shù)量的變化Tab.2 Changes of the number of lymphocytes CD4＋ T cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

表2 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4＋T細(xì)胞數(shù)量的變化Tab.2 Changes of the number of lymphocytes CD4＋ T cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with CTX group.

24.20±8.94 CTX 31.82±3.95 34.01±4.99 33.00±3.16 27.28±2.57 24.95±3.49 Irradiation 33.65±5.75 49.92±5.31＊△△ 35.85±2.48 36.61±4.49△60 75 90 105 120 Control 32.05±7.15 36.69±6.59 33.16±5.51 35.13±2.62△Group No.of CD4＋T cells（t／d）23.77±4.85

2.4 持續(xù)高劑量電磁輻射誘導(dǎo)小鼠外周血CD8＋T細(xì)胞數(shù)量的變化 電磁輻射后，與對(duì)照組比較，輻照組小鼠淋巴細(xì)胞CD8＋T細(xì)胞數(shù)量顯著下降；與加藥組比較，輻照組小鼠在照射后60、75及105dCD8＋T細(xì)胞數(shù)量明顯降低，各組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD8＋T細(xì)胞數(shù)量的變化Tab.3 Changes of the number of lymphocytes CD8＋ T cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

表3 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD8＋T細(xì)胞數(shù)量的變化Tab.3 Changes of the number of lymphocytes CD8＋ T cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with CTX group.

75.80±8.94 CTX 68.18±3.95 66.00±4.99 67.00±3.16 72.72±2.57 75.05±3.49 Irradiation 66.35±5.75 50.08±5.30＊△△ 64.15±2.48 63.40±4.49△60 75 90 105 120 Control 67.95±7.15 63.31±6.59 66.84±5.51 64.87±2.62△Group No.of CD8＋T cells（t／d）76.23±4.85

2.5 持續(xù)高劑量電磁輻射誘導(dǎo)小鼠外周血CD4＋／CD8＋比值的變化 電磁輻射后，輻照組小鼠外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)值呈上升趨勢(shì)，輻照后75d及105d輻照組與對(duì)照組相比顯著上升 （P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠外周血CD4＋／CD8＋比值的變化Tab.4 Changes of the ratios of CD4＋／CD8＋in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

表4 各組小鼠外周血CD4＋／CD8＋比值的變化Tab.4 Changes of the ratios of CD4＋／CD8＋in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with CTX group.

＋0.06 0.33±0.16 CTX 0.47±0.09 0.52±0.12 0.49±0.07 0.37±0.05 0.33±0.06 Irradiation 0.52±0.13 1.02±0.24＊△60 75 90 105 120 Control 0.49±0.16 0.59±0.17 0.50±0.13 0.54±Group CD4＋／CD8（t／d）0.56±0.06 0.58±0.12 0.32±0.08

2.6 持續(xù)高劑量電磁輻射誘導(dǎo)小鼠外周血CD49＋NK細(xì)胞數(shù)量的變化 電磁輻射后與正常對(duì)照組比較，輻照組小鼠淋巴細(xì)胞CD49＋NK細(xì)胞數(shù)量明顯降低 （P＜0.05），表明小鼠免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠外周血CD49＋T細(xì)胞數(shù)量的變化Tab.5 Changes of the number of CD49＋ T cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

表5 各組小鼠外周血CD49＋T細(xì)胞數(shù)量的變化Tab.5 Changes of the number of CD49＋ T cells in peripheral blood of the mice in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with CTX group.

Group No.of CD49＋T cells（t／d）90 105 120 Control 32.44±4.59 19.76±2.75 13.65±2.67 CTX 36.44±1.97 24.38±4.23 20.15±2.88＊Irradiation 22.93±2.24＊△ 15.68±1.71△13.93±2.05

3 討 論

本研究采用隨機(jī)、平行以及獨(dú)立的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，系統(tǒng)建立了慢性高劑量電磁照射小鼠模型，檢測(cè)10mW·cm－2大功率輻照對(duì)小鼠外周血免疫細(xì)胞的影響。為排除熱效應(yīng)的干擾，采用間斷暴露［3］的方法，最終測(cè)定小鼠肛溫在照射前后基本沒(méi)有變化，保證實(shí)驗(yàn)研究的非熱效應(yīng)；同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用共同飼養(yǎng)、輻照，檢測(cè)時(shí)分別采集動(dòng)物樣品，排除感染、疾病等生物學(xué)效應(yīng)對(duì)血象的影響，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

慢性高劑量密度電磁輻射對(duì)小鼠外周血免疫細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)在CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞以及CD4＋／CD8＋比值的變化。本研究結(jié)果顯示：電磁輻射后小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4＋T細(xì)胞數(shù)量高于正常對(duì)照組，與對(duì)照組相比較，照射后75和105d淋巴細(xì)胞CD4＋T細(xì)胞數(shù)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；電磁輻射后，輻照組小鼠淋巴細(xì)胞CD8＋T細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比顯著下降，在照射后60、75及105dCD8＋T細(xì)胞數(shù)量明顯低于給藥組；電磁輻射后輻照組外周血淋巴細(xì)胞CD4＋／CD8＋絕對(duì)值呈上升趨勢(shì)，且明顯高于正常對(duì)照組，在照射后75及105d照射組高于正常對(duì)照組。本研究結(jié)果表明：慢性高劑量電磁輻射可導(dǎo)致小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)降低，外周血淋巴細(xì)胞CD4＋／CD8＋比值有所增大，在檢測(cè)周期結(jié)束時(shí)小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)有恢復(fù)的趨勢(shì)，提示去除高劑量輻射后，小鼠機(jī)體的免疫細(xì)胞數(shù)量可逐漸恢復(fù)。

綜上所述，慢性大功率電磁輻射對(duì)生物體的免疫系統(tǒng)具有一定程度的損傷效應(yīng)［9］，但該方面研究目前還處于基礎(chǔ)研究階段，需要與輻射后小鼠的組織病理?yè)p傷、造血干細(xì)胞的變化情況相結(jié)合，從而進(jìn)行更深入、系統(tǒng)的研究。

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Long－term effects of lasting and high－dose electromagnetic radiation on peripheral blood immune cells in mice

ZHANG Yi－kun1，LI Hui2，HUANG Gen－shan2，DONG Bo3，SU Zhen－tao3
（1.Department of Hematology，General Hospital of PLA Second Artillery Forces，Beijing 100088，China；2.Huangsi Out－patient Department，General Equipment Department Headquarters，Beijing 100021，China；3.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

Objective To study the long－term effects of lasting and high－dose electromagnetic radiation on number and percent of peripheral immune cells in mice and explore the influence of the lasting and high－dose electromagnetic radiation in murine immune system.Methods Thirty BALB／c mice were randomly divided into control group，CTX group and irradiation group.The mice in irradiation group were exposed to electromagnetic radiation at the power density of 10mW·cm－2，30min a day，for 5consecutive days every week，lasting for 4weeks.The mice in CTX group were fed with CTX with the concentration of 30mg·kg－1，for seven times.The number and percents of CD4＋T cells，CD8＋T cells，CD4＋／CD8＋，CD49＋NK cells in peripheral blood cells were detected 30，45，60，75，90，105and 120dafter electromagnetic radiation.Results After high－dose electromagnetic radiation，the number of WBC was increased obviously（P＜0.05）.The number of CD4＋T cells was increased on the 75th day（P＜0.05）and began to decrease on the 90th day，while the number was much more than that in control group（0mW·cm－2）.Until the 120th day，the number of T cells was as the same as the control.After the long－term effect of lasting and high－dose electromagnetic radiation，the number of CD8＋T cells was decreased，and from the 90th day to the 120th day the number of T cells became normal（P＜0.05）.The ratio of CD4＋／CD8＋and the number of CD49＋NK cells were lower than those in control group after irradiation （P＜0.05）.Conclusion Chronic，persistent large doses of electromagnetic radiation can lead to immune system disorders，through detecting the changes in the number of peripheral blood CD4＋T cells，CD8＋T cells，CD49＋NK cells and the proportion of CD4＋／CD8＋，the immune status of mice after irradiation can be found.

electromagnetic radiation；immune cells；mice，inbred BALBC

R358.4

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0856－05

2012－03－07

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題 （2009AA8030421E）

張怡堃 （1972－），女，吉林省長(zhǎng)春市人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事血液腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

張怡堃 （Tel：010－66355109，E－mail：zhangyikun1989＠yahoo.com.cn）