煙霧凝聚物對人正常支氣管上皮細(xì)胞中p16轉(zhuǎn)錄的抑制作用及其機(jī)制

趙艷紅，施新革，吳軍兵，王春仁

（1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所生物材料和組織工程室，北京 100050；2.國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100044；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，河南 衛(wèi)輝 453100；4.中國科學(xué)院生物物理學(xué)研究所，北京 100101）

煙霧凝聚物對人正常支氣管上皮細(xì)胞中p16轉(zhuǎn)錄的抑制作用及其機(jī)制

趙艷紅1，2，施新革3，吳軍兵4，王春仁1

（1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所生物材料和組織工程室，北京 100050；2.國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100044；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，河南 衛(wèi)輝 453100；4.中國科學(xué)院生物物理學(xué)研究所，北京 100101）

目的：通過體外模擬吸煙過程來檢測抑癌基因p16表達(dá)的變化，探討p16基因在吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生過程中的作用。方法：常規(guī)正常支氣管上皮細(xì)胞（HBE）分為實驗組和對照組，分別接受煙霧凝聚物和DMSO處理。利用免疫印跡和Realtime RT－PCR分別檢測P16蛋白表達(dá)和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。構(gòu)建p16的基因組啟動子載體，利用熒光素酶分析煙霧凝聚物對其轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果：不同濃度（0，10，25，50，100mg·L－1）的煙霧凝聚物處理HBE后，其p16的mRNA和P16蛋白表達(dá)水平明顯降低，并且表現(xiàn)出劑量依賴性。大于25mg·L－1的煙霧凝聚物能明顯抑制P16蛋白表達(dá)和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中100mg·L－1煙霧凝聚物表現(xiàn)出最大的抑制效應(yīng)。煙霧凝聚物也能以劑量依賴方式抑制p16啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，大于25mg·L－1的煙霧凝聚物能顯著抑制p16啟動子的熒光素酶活性，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中100mg·L－1的煙霧凝聚物表現(xiàn)出最大的抑制效應(yīng)。結(jié)論：煙霧凝聚物能夠抑制p16啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制P16蛋白的表達(dá)；P16蛋白表達(dá)水平的降低可能是吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生的一種分子機(jī)制。

煙霧凝聚物；肺腫瘤；p16基因

p16基因也被稱作多腫瘤抑制基因 （multiple tumor suppressor 1，MTS），是 Kamb 等［1］于1994年在美國冷泉港發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。p16是一種細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因，直接參予細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂［2］。最新國外研究發(fā)現(xiàn)：p16與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，p16的缺失常見于非小細(xì)胞肺癌組織中［3］。p16缺失在與吸煙關(guān)系最為密切的鱗癌中發(fā)生率較高，而在腺癌中發(fā)生率相對較低［4］。目前國內(nèi)尚沒有關(guān)于p16在吸煙導(dǎo)致肺癌過程中的生物學(xué)作用的研究。本研究采用煙霧凝聚物來模仿吸煙過程，以正常支氣管上皮細(xì)胞HBE作為研究對象，分析煙霧凝聚物對HBE中P16蛋白表達(dá)的影響以及潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE為本研究室保存。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。Western blotting試劑盒購自美國Pierce公司。所有抗體均購自美國Abcam公司。Realtime PCR試劑盒購自Takara公司。雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamine 2000購自美國Invitrogen公司。其他生化試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE常規(guī)培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基（RPMI1640＋10%FBS），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。待細(xì)胞生長到融合度為80%～90%后，利用胰蛋白酶進(jìn)行消化，重新接種。

1.3 煙霧凝聚物制備 將15支13mg焦油含量的紅金龍牌香煙通過50mL注射器與收集瓶相連。通過抽吸裝置，將點燃后香煙釋放的煙霧收集到收集瓶中。將收集瓶置于液氮中使煙霧凝集，然后用DMSO將煙霧凝集物溶解，最終將濃度調(diào)整為10g·L－1。經(jīng)過濾膜過濾滅菌后保存于－80℃冰箱中。采 用 不 同 濃 度 （0、10、25、50 和100mg·L－1）的煙草凝聚物處理HBE，36h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 實時定量PCR 利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體方法參見Invitrogen公司的說明書。將 RNA 定量后，利用 Takara公司的SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ （Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行mRNA定量分析。引物序列如下：p16上游引物為5′－CAACGCACCGAATAGTTACG－3′，下游引物為5′－AGCACCACCAGCGTGTC－3′，擴(kuò)增片段 171bp；18SRNA 上 游 引 物 為 5′－ACATCCAAGGAAGGCAGCAG－3′， 下 游 引 物 為 5′－TCGTCACTACCTCCCCGG－3′，擴(kuò)增片段62bp。18SRNA作為內(nèi)參基因。PCR體系為：SYBR○RPremix Ex Taq Ⅱ（2×），PCR Forward Primer（10μmol·L－1），Reverse Primer （10μmol·L－1），DNA模板50ng，滅菌蒸餾水，總體積20μL。PCR反應(yīng)條件分為3個過程，分別是預(yù)變性（94℃、1min）、擴(kuò)增反應(yīng) （94℃、5s，60℃ 、20s，共40個循環(huán)）及繪制熔解曲線（94℃降溫到65℃后再升溫到94℃）。目的基因相對表達(dá)水平采用2－△△CT方法來計算。即ΔΔCT＝（實驗組目的基因CT－實驗組內(nèi)參基因CT）－（對照組目的基因CT－對照組內(nèi)參基因CT）。為了更清晰表達(dá)各組之間表達(dá)水平的差異，本次研究將對照組的表達(dá)水平設(shè)定為100%。

1.5 免疫印跡（Western blotting）法 用細(xì)胞裂解液（150mmol·L－1NaCl，50mmol·L－1Tris－HCl pH 8.0，1%NP－40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，2mg·L－1胰蛋白酶抑制劑）充分裂解細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。p16mRNA和p16啟動子活性以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 煙霧凝聚物作用下P16蛋白的表達(dá)水平10mg·L－1的煙霧凝聚物處理HBE后，其P16蛋于冰上孵育30min后，4℃、15 000r·min－1離心20min后，收集細(xì)胞總蛋白。取5μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行12%濃度的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。將蛋白通過半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉0.5h后，與抗p16的第一抗體室溫孵育2h。然后與HRP標(biāo)記的兔抗羊第二抗體孵育1h，最后利用化學(xué)發(fā)光試劑盒（普利萊公司）檢測熒光信號。利用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)采集信號。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 利用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體步驟參見Invitrogen說明書。當(dāng)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右后開始轉(zhuǎn)染。用無血清RPMI－1640培養(yǎng)基分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒。然后將二者充分混合，靜置30min，加入到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。4h后將培養(yǎng)基倒掉，加入含血清的完全培養(yǎng)基。

1.7 p16基因啟動子構(gòu)建 根據(jù) Wang等［5］的報道，本文作者克隆了p16基因的啟動子序列（－1～－3017）。本研究利用KpnⅠ和XhoⅠ核酸內(nèi)切酶位點將該序列克隆到pGL3－basic載體中，該載體具有螢火蟲熒光素酶ORS，其轉(zhuǎn)錄水平受插入序列的影響，即插入序列作為啟動子影響熒光素酶基因的表達(dá)。將構(gòu)建成功的載體命名為pGL3－basic－p16。

1.8 啟動子活性分析 采用Promega公司Dual－Luciferase Reporter Assay System雙熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)行啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析。具體步驟參見產(chǎn)品說明書。在96孔板內(nèi)接種待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右后，將pGL3－basic－p16和內(nèi)參質(zhì)粒pRL－SV40轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。48h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，用PLB細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，加入LARⅡ檢測液來檢測螢火蟲熒光素酶活性，然后加入Stop＆Glo檢測液來檢測pRLSV40所表達(dá)的海腎熒光素酶活性。通過計算二者的比值，即能得到熒光素酶的相對活性（relative luciferase activity，RLA）。白表達(dá)水平變化不明顯。當(dāng)煙霧凝聚物的濃度提高到25mg·L－1以上時，P16蛋白表達(dá)水平明顯降低。隨著煙霧凝聚物濃度的升高，P16蛋白的表達(dá)水平也逐漸降低，100mg·L－1的煙霧凝聚物的抑制效應(yīng)最明顯。各組中內(nèi)參基因β－actin的表達(dá)水平趨于一致。見圖1。

圖1 煙霧凝聚物作用下HBE中P16蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 The electrophoregram of the P16protein expression in HBE after treated with cigarette smoke extracts

2.2 煙霧凝聚物作用下p16mRNA的表達(dá)水平10mg·L－1的煙霧凝聚物就能夠引起p16mRNA表達(dá)水平輕度降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著煙霧凝聚物濃度的升高，p16mRNA的表達(dá)水平也逐漸降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。100mg·L－1的煙霧凝聚物能夠誘導(dǎo)高達(dá)38%的抑制效應(yīng)。見表1。

2.3 煙霧凝聚物作用下p16基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性 煙霧凝聚物能夠抑制p16啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，具有一定的劑量依賴性。大于25mg·L－1的煙霧凝聚物均能明顯抑制轉(zhuǎn)錄活性，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），100mg·L－1的煙霧凝聚物表現(xiàn)出最大的抑制效應(yīng)。見表1。

表1 煙霧凝聚物作用下HBE中p16mRNA表達(dá)以及其啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化Tab.1 The changes of p16mRNA expression and its promoter transcriptional activity in HBE after treated with cigarette smoke extracts

3 討 論

吸煙與肺癌的關(guān)系已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被廣泛認(rèn)可。煙草燃燒后形成的煙霧含有幾千種化學(xué)成分［6－7］，其中包括多種致癌物質(zhì)，這些致癌物進(jìn)入人體后的代謝產(chǎn)物能夠干擾正常的細(xì)胞生命活動，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［8］。煙草中的致癌物的代謝產(chǎn)物誘發(fā)癌變的分子機(jī)制：主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA加合物的形成［9］。DNA加合物形成后，不僅能導(dǎo)致癌基因的激活，也能導(dǎo)致抑癌基因的失活。p53是一個典型的煙草致癌物易感基因。近期多個研究［10］表明：煙草致癌物能夠誘導(dǎo)p53基因的DNA加合物形成，從而導(dǎo)致p53基因失活。

p16基因是一個重要的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物是相對分子質(zhì)量為16 000的核蛋白，因此被稱作P16。P16的生物學(xué)功能主要是通過調(diào)節(jié)CDK4來實現(xiàn)的［11］。CDK4是一個參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要基因，其控制著細(xì)胞周期的正常運轉(zhuǎn)。CDK4能夠與細(xì)胞周期素 （cyclin）相結(jié)合，二者周期性的結(jié)合和分離是細(xì)胞周期正常運轉(zhuǎn)的必備條件。CDK4與Cyclin的復(fù)合體主要參與G1－S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控［11］。而P16蛋白能夠抑制CDK4的活性，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。如果p16基因發(fā)生缺失或突變等變異，則不能抑制CDK4的活性，從而使細(xì)胞進(jìn)入無限惡性增殖狀態(tài)，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

目前，p16的缺失和突變已經(jīng)在多種惡性腫瘤組織中被證實，尤其在肺癌組織中，p16存在廣泛的缺失或突變［3，12］，這說明p16與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究利用煙霧凝聚物來模仿吸煙過程，發(fā)現(xiàn)p16是煙霧凝聚物的一個易感基因。HBE經(jīng)煙霧凝聚物處理后，p16mRNA與蛋白的表達(dá)水平變化呈現(xiàn)一致性，即均表現(xiàn)出不同程度的降低，說明P16蛋白表達(dá)水平降低可能是由于其轉(zhuǎn)錄水平改變造成的。進(jìn)一步的p16基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分析證明了本文作者的推測，p16啟動子的轉(zhuǎn)錄活性能夠被煙霧凝聚物明顯抑制。本研究結(jié)果提示：p16缺失可能在吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生過程中起一定的作用。未來的臨床流行病學(xué)與病理學(xué)研究將有助于深入認(rèn)識p16與吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

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Inhibitory effect of cigarette smoke extracts on p16transcription in human normal bronchial epithelial cells and its mechanism

ZHAO Yan－h(huán)ong1，2，SHI Xin－ge3，WU Jun－bing4，WANG Chun－ren1
（1.Department of Biomaterials and Tissue Engineering，Institute for Medical Devices Control，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；2.Center for Medical Device Evaluation／SFDA，Beijing 100044，China；3.Department of Orthopedics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University，Weihui 453100，China；4.Institute of Biophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

Objective To study the role of p16in cigarette smoking－induced lung carcinogenesis by detecting the expression of p16in human normal bronchial epithelial cells（HBE）after exposure to cigarette smoke extracts（CSE）and analyze the underlying mechanism.Methods HBE were treated with various doses of CSE or control DMSO and the protein and mRNA levels of p16were determined by Western blotting and Realtime RT－PCR respectively.The genomic promoter of p16was cloned and its transcriptional activity after exposure to CSE was determined by luciferase assay.Results After the treatment of different doses（0，10，25，50，100mg·L－1）of CSE，the mRNA and protein levels in HBE were significantly inhibited in a dose－dependent manner.More than 25mg·L－1of CSE conld significantly inhibit the p16mRNA and protein levels，there was significant difference compared with control group（P＜0.05）.100mg·L－1of CSE showed the greatest inhibiory effect.Moreover，the transcriptional activity of the promoter of p16was significantly suppressed by more than 25mg·L－1CSE，there was significant difference compared with control group（P＜0.05）.Conclusion Cigarette smoke extracts can inhibit the expression of p16by suppressing its transcriptional activity，indicating that p16might play a key role in cigarette smokinginduced lung carcinogenesis.

cigarette smoke extracts；lung neoplasms；p16gene

Q291

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0841－04

2012－05－17

國家自然科學(xué)基金資助課題 （30870792）

趙艷紅 （1976－），女，遼寧省阜新市人，助理研究員，理學(xué)博士，主要從事腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究。

王春仁 （Tel：010－67095687，E－mail：chunrenwang＠263.net）

時間：2012－08－31 10：54

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20120831.1054.003.html