脊髓NMDA受體對心包內(nèi)注射緩激肽誘發(fā)大鼠心臟－軀體運(yùn)動(dòng)反射的調(diào)節(jié)作用

韓 曼，孫 娜，劉曉華，杜劍青

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，陜西 咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西 西安 710061）

脊髓NMDA受體對心包內(nèi)注射緩激肽誘發(fā)大鼠心臟－軀體運(yùn)動(dòng)反射的調(diào)節(jié)作用

韓 曼1，2，孫 娜2，劉曉華2，杜劍青2

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，陜西 咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西 西安 710061）

目的：觀察鞘內(nèi)注射N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA）受體激動(dòng)劑NMDA及拮抗劑5－甲基－二氫－丙環(huán)庚烯－亞胺馬來酸（MK801）對心包內(nèi)注射緩激肽（BK）誘發(fā)大鼠心臟－軀體運(yùn)動(dòng)反射 （CMR）的影響，探討脊髓水平的谷氨酸受體亞型－NMDA對心臟傷害性感受的調(diào)節(jié)作用。方法：26只雄性SD大鼠隨機(jī)分為BK組（n＝8）、BK＋NMDA組（n＝6）、BK＋MK801組（n＝6）及BK＋MK801＋NMDA組（n＝6），觀察大鼠心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的CMR及鞘內(nèi)注射藥物后CMR的變化，CMR以背斜方肌肌電（EMG）反應(yīng)為觀測指標(biāo)。結(jié)果：心包內(nèi)間隔40min重復(fù)4次注射BK誘發(fā)的CMR無明顯改變（P＞0.05）；鞘內(nèi)注射NMDA后EMG由基礎(chǔ)對照的100%增加到（149.86±8.54）%，注射前后EMG比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；鞘內(nèi)注射MK801后EMG由基礎(chǔ)對照的100%減少到（96.22±2.31）%，但注射前后EMG比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；鞘內(nèi)聯(lián)合注射MK801和NMDA，EMG由基礎(chǔ)對照的100%增加到（103.09±4.13）%，但注射前后EMG比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的CMR具有可靠的重復(fù)性，脊髓水平的NMDA受體參與了CMR的調(diào)節(jié)。

緩激肽；心臟－軀體運(yùn)動(dòng)反射；N－甲基－D－天門冬氨酸；5－甲基－二氫－丙環(huán)庚烯－亞胺馬來酸

心絞痛［1］是冠狀動(dòng)脈供血不足導(dǎo)致心肌急劇的、暫時(shí)性缺血與缺氧所引起的以發(fā)作性胸痛或胸部不適為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。該病是臨床常見病、多發(fā)病，約占心臟常見病的75%，被稱為“人類健康的第一殺手”。因此研究心絞痛中樞調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。動(dòng)物雖無心絞痛的主觀體驗(yàn)，可是存在與其類似的心臟傷害性感受反應(yīng)。Jou等［2］研究發(fā)現(xiàn)：大鼠心包內(nèi)注射致痛物質(zhì)可誘發(fā)心臟－軀 體 運(yùn) 動(dòng) 反 射 （cardiosomatic motor reflex，CMR），并證明了其可作為心臟傷害性感受的一個(gè)可靠指標(biāo)。本課題組在此基礎(chǔ)上通過心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)CMR，并探討了延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)和孤束核對其的調(diào)節(jié)機(jī)制［3－4］。研究［5］表明：谷氨酸（glutamate，Glu）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，脊髓背角中間神經(jīng)元也有大量的Glu，Glu及其受體參與脊髓水平傷害性信息的傳遞和整合。Glu受體激動(dòng)劑能激活脊髓背角傷害性反應(yīng)神經(jīng)元，并且明顯易化外周傷害性刺激誘發(fā)的神經(jīng)元反應(yīng)，而Glu受體拮抗劑則能抑制外周傷害性感受傳入誘發(fā)的背角神經(jīng)元反應(yīng)和痛過敏反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過心包內(nèi)注射緩激肽（bradykinin，BK）誘發(fā) CMR，以背斜方肌的肌電（electromyogram，EMG）反應(yīng)為觀測指標(biāo)，探討脊髓水平的Glu受體亞型N－甲基－D－天門冬氨酸（N－methy1－D－aspartate，NMDA）對CMR的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和藥品 BL－420生物信號采集與分析系統(tǒng)及壓力換能器（成都泰盟生物科技有限公司）；蠕動(dòng)泵（BT100－2J，保定蘭格恒流泵有限責(zé)任公司）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（DW3000－B型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。戊巴比妥鈉、緩激肽、NMDA及MK801（購于美國Sigma公司），藥物均溶解于生理鹽水中，配制成所需濃度（戊巴比妥鈉20和5g·L－1，緩 激 肽 1×10－3g·L－1，NMDA 1.47×10－4g·L－1，MK801 0.68g·L－1），最后pH調(diào)至7.2～7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 26只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～330g，隨機(jī)分為4組：BK組（n＝8）、BK＋NMDA組（n＝6）、BK＋MK801組（n＝6）和BK＋MK801＋NMDA（n＝6）。2%戊巴比妥鈉（45～55mg·kg－1）靜脈注射將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉，暴露左側(cè)背斜方肌，記錄背斜方肌EMG。氣管插管以便對動(dòng)物行人工呼吸（呼吸頻率60～70min－1，潮氣量5.0～6.0mL），左側(cè)頸靜脈插管從而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中維持戊巴比妥鈉的麻醉（10～15mg·kg－1·h－1），右側(cè)頸動(dòng)脈插管監(jiān)測動(dòng)脈血壓。以動(dòng)脈血壓和瞳孔直徑判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉深度。直腸溫度計(jì)監(jiān)測大鼠體溫，通過溫控儀維持大鼠體溫在（37.0±0.5）℃。① 心包插管術(shù)：將左側(cè)上胸部第1～3肋軟骨切斷，暴露胸腺。小心分離胸腺2片小葉，暴露心包膜。用玻璃針的尖端（直徑0.5mm）在心包膜上扎開1個(gè)小孔，將1個(gè)內(nèi)徑0.020cm、外徑0.037cm、長12～14cm遠(yuǎn)端有數(shù)個(gè)小洞的硅膠管順胸腺2葉之間的間隙插入心包約2cm，縫合各層胸壁組織，以固定心包插管。心包內(nèi)每次可注入和抽出的液體量約為0.2mL。② 鞘內(nèi)置管術(shù)及鞘內(nèi)藥物注射：動(dòng)物仰臥位固定在溫控儀上，于兩耳間連線中點(diǎn)處逐層打開皮膚、肌肉，暴露枕骨大孔，用精細(xì)眼科手術(shù)剪小心剪開硬脊膜，看到清亮的腦脊液流出，行鞘內(nèi)置管術(shù)。一段充滿生理鹽水長約10cm PE10導(dǎo)管從枕骨大孔處向脊髓蛛網(wǎng)膜下腔插入長度為3.5～4.0cm置于T3～5脊髓節(jié)段。心包內(nèi)注射BK前15min，取10μL的NMDA（1.47×10－4g·L－1）或 MK801（0.68g·L－1）通過PE10導(dǎo)管向 T3～5脊髓節(jié)段緩慢注入或預(yù)先鞘內(nèi)注射10μL MK801 10min后再注射10μL NMDA。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)該導(dǎo)管注入10μL 2%膀胺天藍(lán)以標(biāo)記藥物的擴(kuò)散范圍，統(tǒng)計(jì)注射位置在T3～5脊髓節(jié)段的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。③心包給藥對心臟重復(fù)傷害性刺激：心包內(nèi)注射BK 0.2mL（1×10－3g·L－1），記錄EMG活動(dòng)60s后回抽，0.2mL溫?zé)釤o菌生理鹽水連續(xù)沖洗心包5次，去除心包內(nèi)殘留的BK，間隔40min重復(fù)心包刺激。每次心包注入BK的同時(shí)記錄EMG，如此反復(fù)4次心包注射。

1.3 EMG的測定 同芯電極以30°的角度插入左側(cè)背斜方肌，記錄其EMG信號，根據(jù)肌肉大小調(diào)節(jié)電極插入深度，一般為1.5～1.7mm。

1.4 大鼠肌電活動(dòng)的記錄 大鼠肌電活動(dòng)采用BL－420軟件進(jìn)行記錄，所記錄的EMG幅度如果超出基線活動(dòng)10%，就可認(rèn)為是由BK誘發(fā)的CMR。每次BK誘發(fā)EMG反應(yīng)總放電單位數(shù)（total number of motor unit discharges，TMUD）通過BL－420分析軟件直接統(tǒng)計(jì)得出。由于不同大鼠BK誘發(fā)的TMUD有所不同，為了消除個(gè)體之間的差異，每只大鼠第1次心包內(nèi)注射BK所誘發(fā)的TMUD被標(biāo)化為100%，作為基礎(chǔ)對照；其后EMG反應(yīng)的TMUD均以第1次心包內(nèi)注射BK所誘發(fā)的TMUD為分母進(jìn)行標(biāo)化，得出百分?jǐn)?shù)，即被標(biāo)化的TMUD，也就是EMG的變化率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各處理因素引起大鼠心包內(nèi)注射BK誘發(fā)CMR的背斜方肌EMG的變化率以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 心包內(nèi)注射BK所誘發(fā)的CMR 每只大鼠心包內(nèi)重復(fù)4次注射BK，每次間隔40min。結(jié)果顯示：每只大鼠心臟重復(fù)4次BK傷害性刺激，不會(huì)引起EMG明顯變化，即大鼠沒有產(chǎn)生耐受現(xiàn)象。第2～4次心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG分別為第1次（基礎(chǔ)對照為100%）的（98.65±1.55）%、（97.21±1.32）%、（97.70±1.98）%（n＝8，P＞0.05）。原始肌電反應(yīng)見圖1。

圖1 心包注射BK誘發(fā)的EMG反應(yīng)Fig.1 EMG response induced by intrapericardial injection of BK

2.2 鞘內(nèi)注射 NMDA、MK801及聯(lián)合注射MK801和NMDA后CMR的變化 BK＋NMDA組大鼠鞘內(nèi)注射10μL NMDA后記錄到的EMG增加 到 基 礎(chǔ) 對 照 的 （149.86±8.54）% （P＜0.05）；BK＋MK801組大鼠鞘內(nèi)注射10μL MK801后記錄到的EMG降低到基礎(chǔ)對照的（96.22±2.31）%，但前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BK＋MK801＋NMDA組大鼠聯(lián)合注射MK801和NMDA后記錄到的EMG增加到基礎(chǔ)對照的 （103.09±4.13）%，但前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。原始肌電反應(yīng)見圖2。

圖2 鞘內(nèi)注射NMDA、MK801及NMDA＋MK801前后EMG的變化Fig.2 Changes of EMG responses before and after intrathecal injection of NMDA，MK801and NMDA＋MK801

3 討 論

以往的研究［5］證明：機(jī)體組織損傷或炎癥時(shí)，受傷細(xì)胞會(huì)釋放出大量內(nèi)源性致痛物質(zhì)，包括BK、腺苷、鉀離子、5－羥色胺、組織胺、前列腺素等。心絞痛發(fā)作時(shí)損傷心肌組織也會(huì)釋放大量的化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)具有單獨(dú)或協(xié)同致痛作用。BK被認(rèn)為是最重要的內(nèi)源性致痛因子，其可通過激活心臟交感神經(jīng)中的A和C類纖維末梢引起疼痛。目前BK作為一種致痛化學(xué)物質(zhì)也被用來誘發(fā)心絞痛和 CMR［2，6－8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：向大鼠心包內(nèi)注射BK可引起背斜方肌產(chǎn)生顯著的EMG反應(yīng)，說明心包內(nèi)注射BK可引起大鼠產(chǎn)生心臟傷害性感受，即CMR。同一只大鼠心包內(nèi)重復(fù)4次，每次間隔40min注射BK所誘發(fā)的EMG活動(dòng)無明顯差異，說明心包內(nèi)注射BK所誘發(fā)的CMR具有可靠的重復(fù)性，證明心包內(nèi)重復(fù)4次注射BK誘發(fā)EMG活動(dòng)的穩(wěn)定性，從而排除了因反復(fù)心包內(nèi)注射BK可能產(chǎn)生的耐受現(xiàn)象，確保鞘內(nèi)注射藥物后對CMR調(diào)節(jié)作用的準(zhǔn)確性。

Glu受體分為兩大類：離子型受體和代謝型受體，其中離子型受體又分為NMDA受體和非NMDA受體。研究［9］發(fā)現(xiàn)：人和大鼠脊髓后角NMDA受體密度較高，特別是后角Ⅰ－Ⅱ?qū)印Ｕ４笫笄蕛?nèi)注射Glu可誘發(fā)痛反應(yīng)行為和脊髓后角cFos的表達(dá)，而鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑可阻斷上述效應(yīng)［10］。本實(shí)驗(yàn)鞘內(nèi)注射NMDA受體特異性的激動(dòng)劑NMDA后可明顯增強(qiáng)心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的CMR，提示脊髓水平NMDA受體的激活易化了大鼠心臟傷害性感受反應(yīng)。相關(guān)研究［11－12］表明：NMDA受體被激活后，活化了脊髓背角的廣動(dòng)力神經(jīng)元內(nèi)的蛋白激酶，繼而滅活了其下游的γ－氨基丁酸和甘氨酸能受體，從而導(dǎo)致抑制性作用的降低，結(jié)果增強(qiáng)了廣動(dòng)力這一類神經(jīng)元的興奮性和反應(yīng)性。同時(shí)，初級傳入中樞突上的突觸前NMDA受體的激活可進(jìn)一步促進(jìn)疼痛相關(guān)物質(zhì)的釋放，使脊髓背角神經(jīng)元敏感化。

MK801為非競爭性NMDA受體拮抗劑，可阻斷NMDA受體耦聯(lián)的Ca2＋通道激活，使Ca2＋內(nèi)流減少，從而使NMDA受體的藥理效應(yīng)減弱，大劑量NMDA對其無翻轉(zhuǎn)作用，故MK801對NMDA受體的阻斷作用是非競爭性的。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，大鼠鞘內(nèi)注射MK801對心包內(nèi)注射BK引起的CMR無影響，但是卻可以顯著地抑制鞘內(nèi)注射外源性NMDA引起的CMR超敏現(xiàn)象，這可能是心包內(nèi)注射BK誘發(fā)心臟傷害性感受時(shí)通過傷害性初級傳入纖維中樞突釋放興奮性氨基酸 （如Glu）的數(shù)量少，不能大量激活脊髓背角NMDA受體，因而鞘內(nèi)注射MK801對CMR無影響。而鞘內(nèi)注射大劑量的外源性的NMDA后可大量激活脊髓背角NMDA受體，通過上述作用，提高脊髓背角廣動(dòng)力神經(jīng)元的興奮性及脊髓背角神經(jīng)元的敏感性，故鞘內(nèi)注NMDA后可明顯易化CMR。預(yù)先鞘內(nèi)注射MK801后再注射NMDA，由于非競爭性阻斷了脊髓背角NMDA受體上NMDA的結(jié)合位點(diǎn)，NMDA受體不能被NMDA激活，其對CMR的易化作用就不能體現(xiàn)出來。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NMDA受體參與了心臟傷害性感受反應(yīng)，即CMR，但具體是NMDA受體哪幾種亞型參與了心臟傷害性信息在脊髓的傳遞，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Modulation of NMDA receptor to rat cardiacsomatic motor reflex induced by intrapericardial bradykinin in spinal cord

HAN Man1，2，SUN Na2，LIU Xiao－h(huán)ua2，DU Jian－qing2
（1.Department of Physiology，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China；2.Department of Physiology and Pathophysiology，College of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To observe the effects of the intrathecal injection of N－methyl－D－aspartate（NMDA）receptor agonist NMDA and antagonist MK801on the cardiacsomatic motor reflex （CMR）induced by intrapericardial bradykinin（BK），and explore the role of Glu receptor NMDA subunit in nociceptive information transmission of the heart in the spinal cord.Methods 26male SD rats were randomly divided into BK group（n＝8），BK ＋ NMDA group（n＝6），BK ＋ MK801group（n＝6），and BK ＋ MK801＋ NMDA group（n＝6）.CMR was induced by intrapericardial BK，and the effects of intrathecal injection of drug in various groups on CMR were observed.The changes of CMR were monitored via electromyogram （EMG）responses of dorsal spinotrapezius muscle to intrapericardial BK.Results There were no significant differences among EMG induced by intrapericardial BK，four times at 40min intervals.Compared with control，the EMG was increased from 100%of control to（149.86±8.54）%by intrathecal injection of NMDA，there was significant difference of EMG between before and after intrathecal injection of NMDA （P＜0.05）.However，the EMG was decreased from 100%of control to（96.22±2.31）%by intrathecal injection of MK801，there was no statistically significant difference（P＞0.05）.The EMG was increased from 100%of control to （103.09±4.13）%by intrathecal combinative injection of MK801and NMDA，there was no significant difference of EMG between before and after intrathecal combined injection of MK801and NMDA（P＞0.05）.Conclusion CMR induced by intrapericardial BK has reliable repeatability and the spinal cord level of NMDA receptor involves in the modulation of CMR.

bradykinin；cardiacsomatic motor reflex；N－methy1－D－aspartate；MK801

R338.22

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0832－04

2012－03－28

國家自然科學(xué)基金資助課題 （31171068）

韓 曼 （1976－），女，陜西省禮泉縣人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事心血管生理基礎(chǔ)方面的研究。

杜劍青 （Tel：029－82657490－802，E－mail：dujianq＠m(xù)ail.xjtu.edu.cn）