單增李斯特菌多克隆抗體制備及其在乳膠凝集試驗中的應用

鞠 文，宋秀玲，原 野，張士堯，方 珍，徐 坤，李 娟，孟日增，3

（1.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學軍需科技學院食品質(zhì)量與安全教研室，吉林 長春 130012；3.吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，吉林 長春 130062）

單增李斯特菌多克隆抗體制備及其在乳膠凝集試驗中的應用

鞠 文1，宋秀玲1，原 野1，張士堯1，方 珍2，徐 坤1，李 娟1，孟日增1，3

（1.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學軍需科技學院食品質(zhì)量與安全教研室，吉林 長春 130012；3.吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，吉林 長春 130062）

目的：制備高效價高純度兔抗單增李斯特菌（LM）多克隆抗體，并初步探討其在乳膠凝集試驗（LAT）中的應用。方法：復蘇并擴大培養(yǎng)LM標準菌株，制備滅活疫苗免疫家兔，采用ELISA法測定耳緣靜脈血抗體效價。4次免疫后，頸動脈采血分離血清，采用辛酸－飽和硫酸銨法粗分離，經(jīng)蛋白親和層析柱HiTrap Protein G HP進行IgG純化，采用SDS－PAGE電泳、紫外分光光度法、間接ELISA法分別測定蛋白純度、蛋白含量及抗體效價。得到的高效價提純IgG與乳膠微球進行共價偶聯(lián)，并選擇偶聯(lián)乳膠的IgG含量及偶聯(lián)時間等條件，建立快速檢測模擬樣品中LM的方法。結果：制備并純化的兔抗LM IgG蛋白濃度為23.364g·L－1，效價為1∶12 800～1∶25 600，與霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀菌等多種菌均無交叉反應，與斯氏李斯特菌有弱交叉反應；致敏時IgG與乳膠微球偶聯(lián)比率為1∶40；利用LAT方法檢測246份樣品，陽性檢出率為87.5%，最低檢出抗原含量為0.039 8g·L－1。結論：制備了高效價、高純度的兔抗LM多克隆抗體；建立的LAT方法特異性強，敏感性較高，重復性好，便于基層推廣使用，為LM的現(xiàn)場檢測提供了一種新手段。

單增李斯特菌；多克隆抗體；乳膠凝集試驗

單核細胞增生性李斯特菌（Lislefia monocylogenes，LM）是對人致病性最強的李斯特菌種，由此引起的食源性疾病也越來越多見，已成為重要的食源性病原菌之一［1］，主要引起腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等嚴重的疾病，其中孕婦感染后經(jīng)胎盤或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒是該病的重要特點之一，病死率高，達30%～40%［2－3］，特別是在孕婦、老年人、幼兒及機體免疫力低下的人群，死亡率可以達到70%［4］，已成為僅次于沙門氏菌感染的第2號致命性食源性病原菌［5］，是目前國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌，也是世界衛(wèi)生組織列入的四大食品致病菌之一。有數(shù)字顯示：美國每年約有1600人感染李斯特菌，255人死亡［6］。2011年9月底美國發(fā)生的毒甜瓜事件就是由于哈密瓜中感染了單增李斯特菌而引起，導致133人被感染，23人死亡，對孕婦的危害還尚難以估量［7］。自1993年以來，我國也不斷有該菌的檢出報道，涉及北京、遼寧、云南、江蘇、河南、重慶、福建、湖南、浙江、四川等多個省份［8－10］。近年來，進口肉類食品中不斷有該菌的檢出［11］，國家質(zhì)檢總局警示禁止進口歐美等地不合格肉類食品。LM的高抵抗力、高檢出性、高病死率、高危害性已成為危害公民健康的巨大威脅，檢測食品中的LM顯得尤為必要和重要，因此建立一種快速準確的檢測技術已成為公共衛(wèi)生檢測領域的一個重點課題。本研究擬制備高效價高純度的兔抗LM多克隆抗體，并與乳膠微球進行偶聯(lián)，初步探討其在乳膠凝集試驗快速檢測病原菌方面的應用。

1 材料與方法

1.1 菌株

LM標準菌株（ATCC19111）及霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀菌等菌株，由吉林出入境檢驗檢疫局技術中心微生物實驗室提供。

1.2 實驗動物

健康新西蘭大白兔，雌性，1～2月齡，體質(zhì)量（2.0±0.2）kg，購自吉林大學動物實驗中心。

1.3 主要試劑

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和10%聚苯乙烯乳膠購自美國Sigma公司，HiTrap Protein G HP蛋白純化柱購自GE公司。

1.4 LM滅活抗原制備

按 GB／T 4789.30－2010中方法培養(yǎng)［12］，以全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)（vitek－2）進行鑒定后，用生理鹽水洗下菌苔制成菌懸液，取1mL 10倍倍比稀釋平板傾注法計數(shù)并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×109cfu·mL－1，用 0.3% 的甲 醛 4℃ 下滅活24h，再用超聲裂解法進一步滅活細菌，平板傾注法進行活菌計數(shù)檢驗是否滅活完全。核酸蛋白檢測儀檢測兩菌懸液蛋白含量。滅活抗原存于4℃低溫冰箱中備用。

1.5 動物免疫

購置的健康雌性新西蘭大白兔于動物室適應性飼養(yǎng)7d，無異常。首次免疫以濃度為2×108cfu·mL－1菌體與等量弗氏完全佐劑乳化完全，每只取1mL背部皮下五點注射，間隔2周后用等劑量的弗氏不完全佐劑疫苗采用同樣方法加強免疫2次，免疫劑量1×108cfu·mL－1×1mL，取血前1周用1×109cfu·mL－1滅活菌苗1mL加強免疫1次。頸動脈采血，分離血清，測定效價。

1.6 多克隆抗體IgG的提純與鑒定

采用辛酸－飽和硫酸銨法粗提取IgG［13］。將粗提的IgG濃縮后加入到蛋白親和層析柱HiTrap Protein G HP，用AKTA蛋白純化儀進行純化。通過對洗脫條件的優(yōu)化進行特異IgG蛋白的收集。獲得的目的蛋白采用超濾離心進行濃縮，用紫外分光光度法測定蛋白含量，用SDS－PAGE電泳進行純度鑒定，間接ELISA法測定其效價，并選擇志賀菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、糞腸球菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌、坂崎腸桿菌及李斯特菌種中的6個屬抗原包被酶標板，進行特異性測定。

1.7 兔抗LM IgG與乳膠顆粒的偶聯(lián)

取10%的聚苯乙烯乳膠0.5mL，加入硼酸緩沖液（pH8.2）4.5mL，混勻制備成1%的乳膠懸液。向上述制備好的乳膠懸液中加入1∶40稀釋的兔抗LM多克隆抗體，當出現(xiàn)凝集現(xiàn)象后繼續(xù)加入，直至凝集現(xiàn)象消失，懸液呈均一穩(wěn)定的狀態(tài)，5 000r·min－1離心30min，硼酸鹽緩沖液洗滌3次后稀釋成原來體積混勻備用，同時制備陰性血清的致敏微球作為對照。

2 結 果

2.1 LM的復蘇活化及鑒定

培養(yǎng)的目的菌經(jīng)全自動生化鑒定系統(tǒng)VITEK－2鑒 定 結 果：AMY、NOVO、OPTO、PIPLC、TyrA、NC6.5、SAL、NAG、dMNE 、dMAL、MBdG、dTRE、AGLU、BACI 為 陽 性 （＋），APPA、LeuA、AlaA、dRIB、dRAF、CDEX、ProA、ILATk、dXYL、AspA、BGURr、dSOR、LAC、dMAN、ADH1、BGAR、AGAL、NRE、SAC、BGAL、AMAN、PyrA、POLYB、PHOS、BGUR、dGAL、PUL、ADH2s 為 陰 性 （－），O129R為疑似陰性（－），LM符合率為94%。

2.2 兔抗LM血清分離及效價測定

以采血時間間隔為橫坐標，血清抗體效價吸光度值比值P／N為縱坐標繪制曲線，可見隨著免疫次數(shù)的增加，抗體效價逐漸升高（圖1）。最終抗體效價≥1∶6 400（表1）。

圖1 兔免疫血清抗體消長Fig.1 The growth progress of the antibody titer of rabbit serum

表1 兔血清抗體效價測定Tab.1 The detection of antibody titer of rabbit serum （±s）

表1 兔血清抗體效價測定Tab.1 The detection of antibody titer of rabbit serum （±s）

Antibody Rabbit No.One week after the 4th immunization 1＜titer of rabbit serum Pre－immunization Before the 2nd immunization Before the 3rd immunization Before the 4th immunization 1∶100 1∶200 1∶1 600 1∶6 400 1∶6 400 2＜1∶100 1∶200 1∶1 600 1∶6 400 1∶6 400 3＜1∶100 1∶200 1∶3 200 1∶6 400 1∶12 800

2.3 兔抗LM IgG的純化結果

利用蛋白親和層析柱HiTrap Protein G HP在AKTA蛋白純化儀中對粗提IgG進行分離提純，通過對洗脫條件的優(yōu)化，最終采用35%洗脫液洗脫峰1洗脫下來，當洗回基線時改用100%的洗脫液將洗脫峰2洗脫下來 （圖2）。兩峰蛋白經(jīng)ELISA及SDS－PAGE電泳檢測，最終確定100%洗脫液的洗脫峰為目的蛋白峰。

2.4 兔抗LM IgG鑒定

圖2 兔抗LM IgG的分離提純結果Fig.2 The results of isolation and purification of anti－LM rabbit IgG

2.4.1 IgG純度鑒定 分別將粗提前、粗提后與純化后兔抗LM IgG經(jīng)SDS－PAGE電泳純度測定：經(jīng)蛋白純化儀純化后，蛋白條帶清晰，純度較高，含有IgG的2條目的條帶 （圖3）。目的條帶分別為重鏈（46 000～58 000）和輕鏈（17 000～25 000），相對分子質(zhì)量約為150 000，與文獻報道相符［13］。

2.4.2 IgG蛋白含量測定 采用紫外分光光度法分別測定吸光度 A280與 A260，利用公式1.45×A280－0.74×A260計算蛋白含量。兔抗LM多克隆抗體純化前蛋白濃度為79.915g·L－1，粗提蛋白濃度為50.778g·L－1，蛋白回收率為63.54%。粗提后的血清經(jīng)蛋白純化儀進行純化，上樣量每次2mL，經(jīng)5次經(jīng)超濾濃縮得濃縮樣，蛋白回收率為2.92%。結果見表2。

2.4.3 效價測定 采用間接ELISA法對純化前后IgG效價進行測定，陽性血清A值／陰性血清A值（P／N）大于2.1的血清最高稀釋倍數(shù)為效價。未純化血清、粗提后和純化后抗體效價分別為：1∶12 800、1∶12 800和1∶25 600。見表3。

圖3 兔抗LM血清純化前后SDS－PAGE電泳圖Fig.3 SDS－PAGE of anti－LM rabbit serum before and after purification

表2 兔血清純化前后蛋白含量測定結果Tab.2 The results of protein content of rabbit serum before and after purification

2.4.4 特異性測定 選擇實驗室保存的13株菌株分別包被ELISA板，測定純化后的IgG與其反應，僅李斯特菌種中的威爾斯氏菌屬呈陽性，其他為陰性，而LM呈明顯的陽性反應。結果見表4。

2.5 乳膠凝集試驗測定結果

2.5.1 自凝試驗結果 用純化后的IgG致敏乳膠后，進行乳膠凝集試驗，陽性及陰性血清致敏微球在生理鹽水中均不發(fā)生自凝，說明致敏乳膠在生理鹽水中穩(wěn)定性良好。

2.5.2 敏感性試驗結果 當抗原稀釋64倍時陽性血清致敏微球凝集試驗陽性，即乳膠凝集試驗的靈敏性達0.039 8g·L－1，而當抗原稀釋倍數(shù)為8時，普通的平板凝集試驗即為陰性，靈敏性僅為0.637g·L－1，表明乳膠凝集試驗的靈敏性高于普通凝集試驗。結果見表5。

表3 ELISA測定純化前后兔抗LM血清抗體效價Tab.3 Titers of rabbit anti－LM serum before and after purification by ELISA

表4 兔抗LM IgG特異性鑒定結果Tab.4 Specific identification results of rabbit anti－LM IgG

表5 LAT的敏感性試驗Tab.5 The sensitivity test of LAT

2.5.3 特異性測定 實驗制備的LM抗體致敏乳膠微球不與空腸彎曲菌、沙門氏菌、陰溝桿菌、糞腸球菌、霍亂弧菌、西爾李斯特菌 （L.seeligeri）、英諾克李斯特菌 （L.innocua）、威爾斯李斯特菌（L.welshimeri）、坂崎腸桿菌、志賀菌屬、綠膿桿菌、綿羊李斯特菌 （L.ivanovii）、無害李斯特菌13種菌株抗原發(fā)生乳膠凝集反應，而與LM呈明顯的凝集反應，表明特異性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性測定 對同一時間致敏乳膠微球在4℃保存半年過程中，多次進行乳膠凝集試驗，與LM抗原反應結果均陽性，且靈敏性變化不大，與非LM抗原不發(fā)生凝集，表明批內(nèi)穩(wěn)定性良好；不同時間制備的致敏乳膠同時進行乳膠凝集試驗，與LM抗原反應結果均為陽性，與非LM抗原不發(fā)生凝集，表明批間穩(wěn)定性良好。

2.6 實際樣品檢測結果

用LAT對246份已知樣品進行檢測，并與GB／T 4789.30－2010檢測方法進行比較，陽性符合率為87.5%。見表6。

表6 LAT和GB兩種方法檢測實際樣品結果Tab.6 The detection results of the samples by two methods of LAT and GB

3 討 論

到目前為止，由LM引起的食物中毒事件在世界各地均有發(fā)生，給國家和社會帶來了巨大的財產(chǎn)和精神損失。WHO曾在LM食品中毒事件報道［14］中指出：4%～8%的水產(chǎn)品、5%～10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均有該菌的污染。因此建立快速、準確、靈敏的檢測技術對于加強出入境食品安全，保證人類健康具有重要意義。本文作者采用背部五點注射法免疫新西蘭兔，每次免疫前收集耳緣靜脈血測定效價，經(jīng)4次免疫后效價達到最高。頸動脈采血收集兔血清，采用不同的純化方法，最終確定辛酸－飽和硫酸銨法粗提取的兔血清純度低，用蛋白親和層析柱HiTrap Protein G HP聯(lián)合AKTA蛋白純化儀對粗提IgG進行進一步分離提純，通過ELISA及SDS－PAGE電泳證實抗體的高效價及高純度。將制備的抗體與乳膠顆粒進行偶聯(lián)，并對偶聯(lián)條件進行了摸索，初步用于乳膠凝集試驗。本研究結果為單克隆抗體標記乳膠微球的制備及應用奠定了基礎，有望替代國家標準中的玻片凝集試驗用于食品中LM的快速檢測。

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Preparation of anti－Listeria monocytogenes polyclonal antibody and its application in latex agglutination test

JU Wen1，SONG Xiu－ling1，YUAN Ye1，ZHANG Shi－yao1，F(xiàn)ANG Zhen2，XU Kun1，LI Juan1，MENG Ri－zeng1，3
（1.Department of Health Laboratory，School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Food Quality and Safety，School of Quartermaster Technology，Jilin University，Changchun 130012，China；3.Inspection and Quarantine Technical Center，Jilin Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun 130062，China）

Objective To prepare the anti－Listeria monocytogenes（LM）polyclonal antibody derived from rabbit and to study the application of LM in latex agglutination test（LAT）.Methods Standard LM strain were cultured and multiplied using selective agents and enrichment procedures.Freund’s complete inactivated vaccine and Freund’s incomplete inactivated vaccine were made for immunizing rabbits.Blood samples were collected from the marginal ear vein and the antibody titers were measured by ELISA.Four times after immunization，blood serum was separated from the carotid artery and crude IgG was purified by using the method of caprylic acid－sulfide saturated soution precipitation.IgG molecules were purified by using the HiTrap Protein G chromatography column on AKTA Protein purification device and identified using the methods of SDS－PAGE electrophoresis， UV spectrophotometry，and indirect ELISA.Purified IgG were covalent conjuncted with latex microspheres and the content of latex and interaction time were optimized.The method was established for rapid detection of LM in simulated samples.Results The protein content of the purified anti－LM IgG was 23.364g·L－1and its antibody titer was 1∶12 800－1∶256 00，no cross－reaction occured with a variety of bacteria such asVibriocholerae，Salmonella，Shigella，but a weak cross－reaction withSteinmannListeriamonocytogenes.The covalent conjuncted ratio of IgG on the latex microspheres was 1∶40and the positive rate was 87.5%for detetion in 246samples by the method of LAT.The minimum detectable content of the antigen was 0.039 8g·L－1.Conclusion LAT is a promising method to facilitate the grassroots level for field testing LM with its specificity，high sensitivity and good reproducibility.

Lislefia monocylogenes；polyclonal antibody；latex agglutination test

R155

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0821－06

2011－04－11

國家自然科學基金資助課題 （81072337）；國家質(zhì)檢總局科技基金資助課題 （2010IK018）；吉林省科技廳科研基金資助課題 （YYZX201123－2）；“2012年吉林大學研究生創(chuàng)新研究計劃”資助課題 （20121120）

鞠 文 （1986－），女，山東省臨沂市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事衛(wèi)生檢驗方面的研究。

李 娟 （Tel：0431－85619419，E－mail：li＿juan＠jlu.edu.cn）；

孟日增 （Tel：0431－87607284，E－mail：mrz1975＠163.com）

時間：2012－08－31 10：50

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20120831.1050.001.html