鹽酸特比萘芬膠囊在比格犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究

王 昂，丁煥中，高 艷，高國峰，曾振靈

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東省獸藥研制與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642;2南京仕必得生物技術(shù)有限公司，江蘇南京211106)

鹽酸特比萘芬為第2代烯丙胺類衍生物，通過特異性的抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性而減少麥角固醇的合成，從而引起菌體細(xì)胞壁破裂而起到殺菌作用，具有最小抑菌濃度低、與血漿蛋白結(jié)合率高(99%)、體內(nèi)分布廣、半衰期長、耐受性好、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)［1］.自特比萘芬在美國上市以來，銷量一直穩(wěn)居前列，成為抗淺部真菌的首選藥物，雖然它還未被批準(zhǔn)應(yīng)用于寵物，但國內(nèi)外獸醫(yī)經(jīng)常用其治療犬和貓的真菌感染性皮膚病，并具有顯著的療效［2-5］.本試驗(yàn)旨在探討比格犬口服鹽酸特比萘芬膠囊的藥物動(dòng)力學(xué)(簡稱藥動(dòng)學(xué))特征及生物利用度，為其臨床應(yīng)用提供給藥方案，提高用藥的有效性和安全性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品與試劑

鹽酸特比萘芬原料藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%)，批號1003002，浙江東亞藥業(yè)有限公司提供;鹽酸特比萘芬對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%)，批號100563—200301，為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;鹽酸特比萘芬膠囊(400 mg/粒，含特比萘芬150 mg)，批號201008121，為南京仕必得生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品.磷酸、硫酸、三乙胺、異丙醇、正己烷均為分析級，乙腈為色譜級.

1.2 主要儀器

Acquity UPLC system液相色譜儀，為Waters公司產(chǎn)品;電子分析天平(AUX120型，SHIMADZU)，酸度計(jì)(PHS-2C型)為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;可調(diào)微量移液器(Eppendorfer research型，20～200 μL、10 ～ 1 000 μL).

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物和給藥

8只健康比格犬，雌雄各半，2～3歲齡，體質(zhì)量(14.85±1.37)kg，由廣東省醫(yī)藥研究總院提供.采用單劑量雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，8只健康比格犬隨機(jī)分為2組:一組靜脈注射自制鹽酸特比萘芬溶液，另一組口服鹽酸特比萘芬膠囊，給藥劑量均為10 mg·kg-1，1周后交叉替換另一種給藥途徑.試驗(yàn)前12 h及給藥后4 h期間禁食，僅自由飲水.

1.4 血樣采集

給藥前(0 h)采空白血，給藥后于0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h 前肢靜脈采血約2 mL，置于含肝素的離心管中，混勻，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，-20℃條件保存至測定.

1.5 血藥質(zhì)量濃度測定及方法學(xué)考察

1.5.1 血漿樣品的前處理 取犬血漿0.5 mL，置于10 mL離心管中，加入4 mL正己烷，200 r·min-1水平震蕩20 min后5 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移正己烷層至新的離心管中，重復(fù)提取1次，合并2次正己烷層，加入1 mL 0.5 mol·L-1的 硫酸-異丙醇溶液(體積比為85∶15)，震蕩 15 min，5 000 r·min-1離心5 min，棄去上層正己烷，取下層硫酸-異丙醇溶液進(jìn)行HPLC檢測，進(jìn)樣量為20 μL.

1.5.2 色譜條件 色譜柱:Hypersil BDS C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -0.1% 三乙胺(體積分?jǐn)?shù)，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5)(體積比為50∶50);檢測波長224 nm;柱溫24℃ ;流速 1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量 20 μL.

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Winnolin 5.2.1程序，利用非房室模型分析血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，獲得特比萘芬單劑量經(jīng)靜注和內(nèi)服給藥在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與生物利用度.

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)研究

在選定的色譜條件下，測定血漿中的特比萘芬準(zhǔn)確性高、分離度好、峰形良好、無干擾峰出現(xiàn)，特比萘芬的保留時(shí)間為10 min，特比萘芬在血漿中的色譜圖見圖1～3.

圖1 比格犬空白血漿色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank plasma of beagle dogs

圖2 比格犬空白血漿添加特比萘芬(0.5 μg·mL-1)色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank plasma added with terbinafine(0.5 μg·mL-1)

圖3 受試比格犬口服特比萘芬膠囊后45 min(0.25 μg·mL-1)的色譜圖Fig.3 Chromatogram of plasma at 45 min(0.25 μg·mL-1)after oral administration in beagle dogs

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿置于10 mL的離心管中，加入鹽酸特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)液適量制得血漿中藥物質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 g·mL-1.按“1.5.1”方法操作，并進(jìn)行色譜分析.以特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)對照品的峰面積(y)對血藥質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=124 516x+248.5，r2=0.999 8，表明本試驗(yàn)條件下特比萘芬在0.05～10.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，血漿中特比萘芬的檢測限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)分別為 0.03和 0.05 μg·mL-1.

2.1.2 絕對回收率和精密度的測定 在空白血漿中加入特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)液適量，配制成低、中、高(0.1、0.5、8.0 μg·mL-1)3 個(gè)質(zhì)量濃度的特比萘芬血漿樣品，按“1.5.1”中血漿樣品的處理操作，進(jìn)行高效液相色譜測定，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)重復(fù)，共3批.結(jié)果表明，3個(gè)添加質(zhì)量濃度的絕對回收率均在78.76% ～80.67%范圍內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)在3.15% ～4.25%之間，批間變異系數(shù)在3.37% ～4.63%之間.

2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析

采用Winnolin 5.2.1程序利用非房室模型分析血藥質(zhì)量濃度(C)-時(shí)間數(shù)據(jù)得到比格犬靜注和口服特比萘芬的平均藥時(shí)曲線圖見圖4，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1.

圖4 比格犬靜注(10 mg·kg-1)和口服(10 mg·kg-1)特比萘芬的血漿質(zhì)量濃度(C)與時(shí)間曲線(n=8)Fig.4 Plasma concentration-time curves of terbinafine after intravenous(10 mg·kg-1)and oral(10 mg·kg-1)administration in beagle dogs(n=8)

表1 比格犬靜注、口服特比萘芬后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=8)1)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters determined following intravenous(10 mg/kg)and oral(10 mg/kg)administration terbinafine in beagle dogs(n=8)

3 討論與結(jié)論

本研究采用 Denou?l等［6］所采用的提取方法，并在此基礎(chǔ)上改為正己烷提取2次，處理后的血漿樣品無雜質(zhì)干擾，提高了特比萘芬的回收率，靈敏度與特異性均較高，通過對血漿或組織樣本的HPLC測定方法精密度、回收率的測定，說明本法具有專屬性、準(zhǔn)確性、靈敏度高的特點(diǎn)，適合特比萘芬生物樣品含量的測定.

本研究報(bào)道了比格犬靜注特比萘芬后的藥動(dòng)學(xué)特征及口服給藥的絕對生物利用度，血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)表明，比格犬靜注特比萘芬后，采用非房室模型分析，其Vss=(2.55±0.89)L·kg-1，t1/2=(3.02±1.70)h，表明其在比格犬體內(nèi)分布廣泛，消除快，口服鹽酸特比萘芬膠囊后，Vd/F=(35.17±6.58)L·kg-1，t1/2=(1.69±0.74)h，表觀分布容積與國外報(bào)道相一致，但是其消除半衰期要遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于鹽酸特比萘芬片劑的研究報(bào)道結(jié)果(8～16 h)［1，7-9］，這可能與藥物的不同劑型有關(guān)，可能片劑在體內(nèi)有緩釋效果，而膠囊劑型則瞬間崩解，不具有緩釋作用.

比格犬口服鹽酸特比萘芬膠囊的生物利用度僅為(12.54±3.43)%，這可能與該藥物口服具有首過效應(yīng)有關(guān)［9-10］.雖然特比萘芬的生物利用度很低，但是已有文獻(xiàn)表明它具有較強(qiáng)的脂溶性，能夠廣泛分布于毛發(fā)，皮膚，角質(zhì)層和甲等［11-12］.

目前關(guān)于抗真菌藥物療效的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(t＞MIC，AUC/MIC或Cmax/MIC)還并沒有建立，而且這些參數(shù)是否能用于抗真菌藥物還并未得知，因此我們還不知道特比萘芬的殺菌機(jī)制是濃度依賴型還是時(shí)間依賴型.由于特比萘芬在人、犬和兔子中的血漿蛋白結(jié)合率大于99%［1］，而對于血漿中游離濃度小于20%的藥物而言，組織或細(xì)胞中的濃度更適合用來進(jìn)行藥物療效和劑量的推測［13］.對于像特比萘芬這種對組織親和性很強(qiáng)的藥物，在感染部位的藥物濃度要比血漿中的濃度顯得更有意義，因此進(jìn)行特比萘芬在犬體內(nèi)的多次給藥的藥動(dòng)學(xué)研究以及在組織部位的濃度非常有必要.

本文試驗(yàn)所用的犬為比格犬，體外研究表明，比格犬純化的肝微粒體對異丙酚的代謝要快于灰犬的肝微粒體［13-15］，而灰犬與雜種犬并沒有表現(xiàn)出代謝速度的不同，這說明比格犬能夠較快地代謝異丙酚.安替比林為進(jìn)行藥物代謝的細(xì)胞P450酶的探針底物，也是評價(jià)藥物分布到總體液的程度的一個(gè)標(biāo)志物.KuKanich等［16］進(jìn)行了安替比林在比格犬和灰犬體內(nèi)的比較藥動(dòng)學(xué)，結(jié)果表明，比格犬對安替比林的CL為 13.42 mL·min-1·kg-1，而灰犬為 8.33 mL·min-1·kg-1;Vd在 比 格 犬 體 內(nèi) 為 613 mL·kg-1，在灰犬體內(nèi)為760 mL·kg-1;比格犬對安替比林的t1/2為0.55 h，灰犬為1.09 h.安替比林在雜種犬的CL為9.1 mL·min-1·kg-1，Vd為640 mL·kg-1，t1/2β為 1.13 h［17］.安替比林在雜種的 CL和t1/2β與灰犬相似，而與比格犬則明顯不同.安替比林在 浣 熊 犬 的 CL、Vd和 t1/2β分 別 為:6.2 mL·min-1·kg-1、668 mL·kg-1和 1.24 h［18］，由此看來，比格犬對由細(xì)胞色素P450氧化酶介導(dǎo)的大多數(shù)藥物的代謝要不同于其他犬種.

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