豬體內(nèi)金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性調(diào)查及耐藥基因分布研究

林大川，劉健華，王 晶，孫 娜，郭瀟木，魏鴻堃，馮言言，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

葡萄球菌Staphylococci是一種革蘭陽(yáng)性球菌，其種類繁多，是人畜共患病的重要病原菌之一，可引起人類和動(dòng)物的感染性疾病，對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成危害.此外，動(dòng)物體內(nèi)的葡萄球菌還可以作為耐藥基因的貯存庫(kù)，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅［1-2］.葡萄球菌對(duì)豬自身的影響很小，但卻能通過豬與人類的接觸而造成人類感染，尤其是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methecillin resistance Staphylococcus aureus，MRSA)ST398，常見于豬體內(nèi)及與豬接觸過的人類［3］.近年來(lái)有關(guān)豬體內(nèi)金黃色葡萄球菌的研究備受關(guān)注，尤其是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌.多個(gè)國(guó)家已報(bào)道從豬體內(nèi)不同部位分離到耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，但其檢出率差異很大，如日本0.9%(鼻 腔)［4］、美 國(guó) 11.13%［5］(鼻 腔)、印 度3.89%(鼻腔)［6］、西班牙 85.7%(屠宰場(chǎng))［3］.凝固酶陰性葡萄球菌以前被認(rèn)為致病性不強(qiáng)而被忽視，但近年其引起的感染有上升趨勢(shì)，此外，凝固酶陰性葡萄球菌還可以作為耐藥基因的存儲(chǔ)庫(kù)，將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病性強(qiáng)的金黃色葡萄球菌，豬體內(nèi)的凝固酶陰性葡萄球菌有可能感染人類［7］.因此，研究豬源凝固酶陰性葡萄球菌的流行性和耐藥情況也是十分必要的.近年來(lái)，由于抗菌藥物長(zhǎng)期、不合理應(yīng)用導(dǎo)致葡萄球菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，耐藥譜越來(lái)越廣，給臨床治療帶來(lái)了困擾.目前，國(guó)外有關(guān)葡萄球菌耐藥性和耐藥機(jī)制的研究報(bào)道較多，國(guó)內(nèi)關(guān)注度也逐年上升［8］.豬是一種常與人類接觸的動(dòng)物，對(duì)葡萄球菌在動(dòng)物和人類之間的傳播起到重要的作用，所以調(diào)查豬體內(nèi)金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的耐藥情況具有重要的作用.本研究通過調(diào)查豬體內(nèi)金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況及其主要耐藥基因的流行情況，為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2010年收集來(lái)自廣州(35)、佛山(42)、江門(17)、珠海(23)、惠州(27)、東莞(12)、清遠(yuǎn)(13)、肇慶(12)、中山(13)及其他地區(qū)(36)的共計(jì)230份病豬淋巴結(jié)樣品.樣品于4℃條件保存并于48 h內(nèi)分離葡萄球菌.

1.1.2 培養(yǎng)基和藥品 MH瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂、BP瓊脂、NaCl高鹽肉湯、亞碲酸卵黃增菌液、過氧化氫、兔血漿均為青島海博生物有限公司產(chǎn)品.14種抗菌藥物為杭州天河微生物試劑有限公司產(chǎn)品，w(紅霉素)=99%、w(克林霉素)=99%、w(環(huán)丙沙星)=90%、w(慶大霉素)=96%、w(氯霉素)=90%、w(頭孢噻呋)=85%、w(青霉素G)=92%、w(氨芐西林)=95%、w(苯唑西林)=95%、w(四環(huán)素)=93%、w(阿奇霉素)=95%、w(萬(wàn)古霉素)=95%、w(利福平)=99% 和w(利奈唑胺)=99%.

1.1.3 分子試劑 溶葡萄球菌素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，蛋白酶 K、rTaq酶、dNTPs、PCR Buffer均為TaKaRa公司產(chǎn)品.引物由北京華大基因公司合成.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 將采集的樣品置于滅菌的LB肉湯中培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取菌液在BP瓊脂平板和血平板上劃線培養(yǎng)［3］.葡萄球菌在BP培養(yǎng)基瓊脂平板上呈圓形、表面光滑、凸起、濕潤(rùn)的菌落，顏色呈灰色至黑色，在血平板上菌落呈白色至金黃色，周圍有時(shí)有溶血圈.挑取可疑單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)和鑒定.

1.2.2 細(xì)菌的鑒定 經(jīng)革蘭染色后，鏡檢選取革蘭染色陽(yáng)性、呈葡萄串狀排列的菌落做凝固酶試驗(yàn)，凝固體積大于原體積的1/2，被判定為陽(yáng)性結(jié)果.同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照［9-10］.采用PCR方法鑒定金黃色葡萄球菌［11］，MRSA 按 Neeling 等［12］的方法擴(kuò)增 mecA基因來(lái)確認(rèn).按照 Hirotaki等［13］的方法通過多重PCR方法檢測(cè)與人相關(guān)的9種凝固酶陰性葡萄球菌，并確認(rèn)其中沒有里昂葡萄球菌.

1.2.3 藥物敏感性檢測(cè) 按照CLSI所推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)［14］，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定敏感或耐藥，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213.

1.2.4 模板的提取 參考Unal等［15］的方法提取葡萄球菌DNA模板，挑取單菌落接種于腦心浸液肉湯過夜培養(yǎng)，離心細(xì)菌培養(yǎng)液，洗滌后再重新懸浮菌體，100℃水浴密封加熱，4℃離心，取上清液作為PCR模板，于-20℃條件保存?zhèn)溆?

1.2.5 耐藥基因PCR檢測(cè) 根據(jù)耐藥性檢測(cè)結(jié)果，采用PCR方法對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類等藥物耐藥的葡萄球菌進(jìn)行13種耐藥基因的檢測(cè).參考已發(fā)表的引物序列［10，16-20］分別合成 ermA、ermB、ermC、linA、msrA、msrB、tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL和 mecA基因的引物，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1.

表1 耐藥基因PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers used for PCR

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的分離

本次調(diào)查共采集豬淋巴樣品230份，其中金黃色葡萄球菌檢出19份，檢出率為8.3%;凝固酶陰性葡萄球菌檢出71份，檢出率為30.7%.在分離鑒定出的90株葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌占檢出總葡萄球菌的21.1%.和人相關(guān)的9種葡萄球菌多重PCR電泳見圖1.根據(jù)Hirotaki等［13］報(bào)道 ，里昂葡萄球菌多重PCR條帶大小為695 bp，本次調(diào)查中未檢出里昂葡萄球菌.腐生葡萄球菌(843 bp)4株、沃氏葡萄球菌(999 bp)1株、溶血葡萄球菌(434 bp)2株，大部分凝固酶陰性的葡萄球菌不是與人相關(guān)的9種葡萄球菌.

圖1 檢測(cè)和人相關(guān)的9種葡萄球菌多重PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis after multiplex PCR for species identification of human-associated Staphylococci

2.2 金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的藥物敏感性

金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的耐藥率見表2.從表2可以看出，金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)臨床常用抗菌藥物環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、青霉素、氨芐西林、四環(huán)素、克林霉素、阿奇霉素、紅霉素，多重耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重;金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥率差異極顯著(P＜0.01)，凝固酶陰性葡萄球菌明顯高于金黃色葡萄球菌.本研究未檢出耐利奈唑胺及萬(wàn)古霉素的葡萄球菌.

表2 金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的藥物敏感性1)Tab.2 The antimicrobial susceptibility of the Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococci

2.3 金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的耐藥基因攜帶率

金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見表3.從表3可以看出，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因中金黃色葡萄球菌攜帶最多的為ermC基因(36.8%)，而凝固酶陰性葡萄球菌攜帶最多的是ermB基因(49.3%).金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌linA、ermB基因的攜帶率差異顯著(P＜0.05)，凝固酶陰性葡萄球菌明顯高于金黃色葡萄球菌.

表3 金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌菌株中耐藥基因的個(gè)數(shù)1)Tab.3 The number of resistance genes in Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococci

3 討論與結(jié)論

本次調(diào)查中金黃色葡萄球菌在豬體內(nèi)檢出率為8.3%，與Cui等［21］在中國(guó)多省份豬樣品中金黃色葡萄球菌檢出率(58/509)及Lin等［22］在臺(tái)灣調(diào)查結(jié)果類似，但明顯低于常建軍［23］報(bào)道的檢出率(66.7%)，這可能與金黃色葡萄球菌鑒定方法的不同有關(guān).根據(jù)全國(guó)衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2006—2007年度報(bào)告，84家三級(jí)甲等醫(yī)院的金黃色葡萄球菌占總檢出葡萄球菌的30.9%［24］，Jenssen 等［25］在3家醫(yī)院調(diào)查中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌占總檢出葡萄球菌的30.6%，而本研究金黃色葡萄球菌占檢出總葡萄球菌的21.1%，由此可見金黃色葡萄球菌的宿主主要是人類.本次鑒定凝固酶陰性葡萄球菌用的是9對(duì)與人相關(guān)的葡萄球菌引物檢測(cè)，僅僅檢出腐生葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和溶血葡萄球菌共7株(7/71)，大部分凝固酶陰性葡萄球菌不是與人相關(guān)的9種葡萄球菌，與Huber等［7］在畜禽體內(nèi)的凝固酶陰性葡萄球中松鼠葡萄球菌、福氏葡萄球菌占大多數(shù)的調(diào)查結(jié)果相符.

本研究分離到的豬源葡萄球菌對(duì)臨床常用抗菌藥物均存在一定的耐藥性，且對(duì)多數(shù)藥物耐藥情況嚴(yán)重，其中對(duì)紅霉素的耐藥率為87.8%(79/90)，與人醫(yī)臨床分離葡萄球菌對(duì)紅霉素的耐藥率［26］相似;對(duì)克林霉素的耐藥率為86.7%(78/90)，與醫(yī)學(xué)臨床分離的金黃色葡萄球菌的耐藥率［27］相似.但Lüthje等［28］調(diào)查的奶牛源凝固酶陰性葡萄球菌耐藥情況明顯低于本研究結(jié)果，可能與臨床用藥有關(guān).

金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌耐藥情況類似，僅對(duì)苯唑西林的耐藥性差異極顯著.與孫宏莉等［29］調(diào)查凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)苯唑西林敏感性遠(yuǎn)低于金黃色葡萄球菌結(jié)果類似.這可能與耐藥的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān).根據(jù)CLSI的判斷標(biāo)準(zhǔn)，苯唑西林MIC≥4 mg/L或檢測(cè)出mecA基因的金黃色葡萄球菌確定為耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，而對(duì)于除里昂葡萄球菌以外的凝固酶陰性葡萄球菌苯唑西林MIC≥0.5 mg/L或檢測(cè)出mecA基因確定為耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS).

目前，有關(guān)葡萄球菌耐藥機(jī)制的研究報(bào)道較多，其中廣受關(guān)注的MRSA主要是獲得了外源性mecA基因，該基因編碼青霉素結(jié)合蛋白2a，造成對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥.大環(huán)內(nèi)脂、林可胺類不僅廣泛用于畜禽細(xì)菌性和支原體感染的化學(xué)治療，同時(shí)也是人醫(yī)臨床用于治療葡萄球菌感染的一線藥物.金黃色葡萄球菌主要通過ermA、ermB和ermC基因的產(chǎn)物來(lái)甲基化修飾堿基而得到耐藥性，ermA基因是20世紀(jì)70年代以前金黃色葡萄球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的主要決定基因，但此后ermC基因則取代ermA基因成為主要耐藥基因，ermB基因則少見［10］.林可霉素與克林霉素也主要是由23S rRNA甲基化酶erm、編碼ATP外排泵的msrA基因以及l(fā)inA基因介導(dǎo)耐藥.

四環(huán)素是一種廣譜抗菌藥物，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床疾病的預(yù)防與治療，四環(huán)素的耐藥情況及耐藥基因流行情況在一定程度上反應(yīng)了耐藥的嚴(yán)重程度.荷蘭研究人員Neeling等［30］從豬農(nóng)及其豬上分離到44株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素均有耐藥性，由此提示豬場(chǎng)普遍使用了四環(huán)素類抗生素，與本文調(diào)查金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素耐藥率78.9%結(jié)果相似.本次在豬體內(nèi)四環(huán)素耐藥表型及耐藥基因調(diào)查結(jié)果與李宏等［31］對(duì)人醫(yī)臨床患者的金黃色葡萄球菌調(diào)查結(jié)果及丁兆鳳等［32］對(duì)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌結(jié)果類似.

吳偉元等［33］在溶血葡萄球菌中檢測(cè)出大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類耐藥基因msrA/msrB、linA，其檢出率分別為59.7%和50%，與本研究凝固酶陰性葡萄球菌耐藥基因linA(62.0%)和ermB(49.3%)類似.研究表明，不同葡萄球菌菌種其耐藥基因型存在明顯的差異［10］.本研究中金黃色葡萄球菌以 ermC基因?yàn)樽钪饕蟓h(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(7/19)，而凝固酶陰性葡萄球菌攜帶最多的是ermB基因(49.3%)，與Schmitz等［34］對(duì)德國(guó)的醫(yī)院調(diào)查結(jié)果類似(68/134;50.7%).同來(lái)源的金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌耐藥基因的比較在人醫(yī)領(lǐng)域研究較多［35］，在獸醫(yī)領(lǐng)域研究則較少.本研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌linA基因檢出率差異顯著，msrA基因檢出率雖然差異不顯著，但凝固酶陰性葡萄球菌多于金黃色葡萄球菌，與Lina等［10］在法國(guó)醫(yī)院的調(diào)查結(jié)果相同.

本研究結(jié)果表明，目前豬體內(nèi)葡萄球菌耐藥較嚴(yán)重，對(duì)臨床上常用藥物耐藥率較高，且為多重耐藥;凝固酶陰性葡萄球菌與金黃色葡萄球菌耐藥表型和基因型類似，提示凝固酶陰性葡萄球菌不僅作為一種潛在致病菌存在于豬體內(nèi)，而且為金黃色葡萄球菌提供了大量耐藥基因，加劇了耐藥金黃色葡萄球菌的產(chǎn)生.

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