山梨酸對C2C12細胞增殖、IGF-1分泌和相關基因表達的影響

方心靈，王海峰，束 剛，王松波，朱曉彤，王麗娜，高 萍，江青艷

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州510642)

山梨酸(Sorbic acid，SA)，學名為2，4-己二烯酸，含有羧基和共軛雙鍵等功能性基團，是一種不飽和直鏈脂肪酸(CH3C H ═ C HCH═CHCOOH).在飼料工業(yè)上，SA是一種重要的酸化劑和防霉劑，具有調節(jié)仔豬胃腸道微生物種群平衡、降低腹瀉率、促進營養(yǎng)物質消化吸收、抑制飼料霉菌生長等作用［1］.另外，SA可通過β氧化的代謝途徑為機體提供能量，且對動物機體無毒副作用［2-3］.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院生理生化實驗室前期研究表明，日糧添加SA(0.05% ～0.40%)能夠提高斷奶仔豬的日增體質量和血液 IGF-1濃度，并且可能是通過促進肝細胞IGF-1的表達和分泌實現(xiàn)的［4］.此外，日糧中添加0.6%SA能夠降低黃羽肉雞胸肌和腿肌的失水率和pH1h［5］.然而，動物的生長性能和肉品質的提高與骨骼肌細胞的增殖及糖脂代謝水平的改變有密切關系.因此，本試驗以C2C12小鼠骨骼肌成肌細胞為模型，研究SA對C2C12細胞增殖、IGF-1分泌以及相關基因表達的影響，旨在深入揭示 SA的促生長機制.

1 材料與方法

1.1 試驗細胞株和試劑

C2C12小鼠骨骼肌成肌細胞株為華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院生理生化實驗室保存.

新生胎牛血清(GIBCO，美國);高糖DMEM和DMEM/F12(Hyclone，美國);胰島素和山梨酸(Sigma，美國);MTT(北京鼎國);蛋白裂解抽提試劑和蛋白定量試劑盒(北京百泰克);Trizol(Invitrogen，美國);10×DNase I Buffer、DNase I(RNase-free)、Ribonuclease inhibitor和 Oligo d(T)-18 Primers(TaKaRa，日本);dNTP Mix(Fermentas，立陶宛);M-MLV Reverse Transcriptase(Promega，美國);Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，日本);引物合成(北京奧科);IGF-1放免測定試劑盒(天津九鼎).

1.2 山梨酸對C2C12細胞增殖的影響

1.2.1 細胞生長標準曲線的繪制 用DMEM完全培養(yǎng)液(體積分數(shù)為10%的胎牛血清)將C2C12細胞稀釋至0.6×104、1.2×104、2.4 ×104、4.8 ×104和9.6×104孔-1的密度梯度并接種于96孔板，同時設不含細胞的DMEM完全培養(yǎng)液作為空白對照(100 μL/孔，n=8)，于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h.采用MTT法［6］檢測每個細胞密度梯度對應的Dλ值.

1.2.2 細胞生長曲線的繪制 用DMEM完全培養(yǎng)液將C2C12細胞以0.6×104mL-1密度接種于96孔板中(100 μL/孔，n=24)，待細胞全部貼壁并生長至70%～80%融合時，更換為含SA的培養(yǎng)液處理細胞.

1)分別用含 10.0和 100.0 μmol/L SA的DMEM完全培養(yǎng)基換液，觀察SA在有血清條件下對C2C12細胞增殖的影響(1和2 d).

2)分別用含1.0和10.0 μmol/L SA的DMEM/F12培養(yǎng)基(含2.5 mg/mL人胰島素)換液，觀察SA在無血清條件下對C2C12增殖的影響(1、2、3、4和5 d).

采用MTT法測得各組細胞Dλ值，結合細胞生長標準曲線，計算出各階段的細胞數(shù).

1.3 山梨酸對 C2C12細胞 IGF-1分泌和基因mRNA表達的影響

將 C2C12細胞以1.5×104mL-1接種到含DMEM完全培養(yǎng)液的24孔板中(1.5 mL/孔，n=6)，待細胞全部貼壁并生長至70% ～80%融合時，更換為含 SA的 DMEM/F12無血清培養(yǎng)液(含2.5 mg/mL人胰島素)處理細胞［7］.

1)觀察 0、0.1、1.0、10.0 和 100.0 μmol/L SA在無血清條件下對C2C12細胞IGF-1分泌的影響(1、2、3、4和5 d).處理結束后，采用 RIA 檢測細胞上清液IGF-1質量濃度，方法參照放免試劑盒進行;采用通用蛋白裂解抽提試劑裂解細胞沉淀，然后使用BCA法蛋白定量試劑盒測定總蛋白的濃度.

2)觀察1.0 μmol/L SA在無血清條件下對C2C12細胞相關基因表達的影響(3 d).處理結束后，去除培養(yǎng)上清液，迅速置于-80℃條件保存.

1.4 相關基因mRNA表達量的測定

1)總RNA抽提:利用Trizol一步法分別提取C2C12細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測其濃度和純度，利用普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性.

2)總RNA消化:反應體系為16 μg總RNA、2.0 μL 10 × DNase I Buffer、1.0 μL 5 U/μL DNase I(RNase-free)、0.5 μL 40 U/μL Ribonuclease inhibitor，加入DEPC處理水至20.0 μL;反應條件為37℃溫育30 min，65℃ 5 min.

3)反轉錄:2 μg 消化后總 RNA、3.0 μL 5 μmol/L的 Oligo d(T)-18，加入 DEPC 處理水至 15.0 μL，70℃預變性5 min，迅速取出并立即冰浴2 min.分別加入5.0 μL 5 × Buffer、1.0 μL 200 U/μL M-MLV反轉錄酶、0.625 μL 40 U/μL Ribonuclease inhibitor、1.25 μL 10 mmol/L dNTP，加入 DEPC 處理水至25.0 μL;42℃反應60 min，70℃ 10 min.

4)Real-time qPCR:根據(jù)NCBI中GenBank發(fā)表的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計各基因的上、下游引物(見表1).反應體系為1.0 μL反轉錄產(chǎn)物、0.8 μL 5 μmol/L 引物、10.0 μL 2 × SYBR Green I Mix，加入去離子水至20.0 μL.反應條件為94℃ 1 min預變性;94℃ 15 s，58 ～ 67℃ 15 s，72℃ 40 s，40個循環(huán).獲得各基因Ct值，以 β-actin作為內參，采用2-ΔCt法計算樣品中各基因mRNA表達豐度.

表1 C2C12細胞各基因引物序列及擴增參數(shù)Tab.1 Gene primer sequences and amplification parameters of C2C12 cells

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

全部數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，細胞增殖和IGF-1分泌指標采用單因素方差分析和Turkey法進行多重比較，基因表達指標采用獨立樣本t檢驗.

2 結果與分析

2.1 山梨酸對C2C12細胞增殖的影響

2.1.1 山梨酸對有血清培養(yǎng)的C2C12細胞增殖的影響 由圖1可知，SA可促進體積分數(shù)為10%胎牛血清培養(yǎng)的C2C12細胞增殖.10.0和100.0 μmol/L SA處理1和2 d，均能顯著促進C2C12細胞增殖(P＜0.05);其中，10.0 μmol/L SA組在第2天時的促增殖效應顯著高于100.0 μmol/L SA組(P＜0.05).

圖1 SA對有血清培養(yǎng)的C2C12細胞增殖的影響Fig.1 Effects of SA on proliferation of C2C12 skeletal muscle cells with serum culture

2.1.2 山梨酸對無血清培養(yǎng)的C2C12細胞增殖的影響 由圖2可知，除第1天外，隨著SA濃度的升高，C2C12細胞增殖均有提高的趨勢.其中，10.0 μmol/L SA能顯著促進后期(4和5 d)C2C12細胞的增殖(P＜0.05).

圖2 SA對無血清培養(yǎng)的C2C12細胞增殖的影響Fig.2 Effects of SA on proliferation of C2C12 skeletal muscle cells with serum-free culture

2.2 山梨酸對無血清培養(yǎng)的C2C12細胞上清IGF-1含量的影響

從圖3可知，隨著SA濃度的增加，C2C12細胞上清IGF-1的質量濃度呈倒N形的趨勢.除第1天外，0.1和1.0 μmol/L SA均能顯著抑制IGF-1的分泌量(P＜0.05);且在第4天時，1.0 μmol/L SA組的抑制顯著效應高于0.1 μmol/L SA組(P＜0.05).與對照組相比，10.0 μmol/L SA組對IGF-1分泌量均無顯著作用(P＞0.05).當SA濃度增加至100.0 μmol/L時，IGF-1分泌在5個時間點均呈現(xiàn)抑制的趨勢.

圖3 SA對無血清培養(yǎng)的C2C12細胞上清IGF-1含量的影響Fig.3 Effects of SA on IGF-1 secretion of C2C12 skeletal muscle cells with serum-free culture

2.3 SA對無血清培養(yǎng)的C2C12細胞相關基因表達的影響

由圖4可知，1.0 μmol/L SA顯著上調 GHR、IGF-1R和CPT1b mRNA表達(P＜0.05)，并且有提高 IGFBP3(P=0.09)、PDK4(P=0.10)和 PGC1α(P=0.10)mRNA表達量的趨勢.

圖4 SA對無血清培養(yǎng)的C2C12細胞GH/IGF系統(tǒng)和糖脂代謝相關基因mRNA表達的影響Fig.4 Effects of SA on GH/IGF system，glucose and lipid metabolism-related genes mRNA expression of C2C12 cells with serum-free culture

3 討論

3.1 SA對C2C12骨骼肌成肌細胞增殖的影響

有大量研究表明，脂肪酸尤其不飽和脂肪酸(UFA)對骨骼肌細胞的增殖和功能有重要作用［8］.單不飽和脂肪酸(MUFA)的油酸(OA)和n-6系列多不飽和脂肪酸(PUFA)的亞麻酸(LA)、γ-亞麻酸(GLA)及花生四烯酸(AA)均能促進C2C12細胞的增殖(含體積分數(shù)為5%胎牛血清DMEM)，而n-3系列PUFA和飽和脂肪酸(SFA)對C2C12細胞增殖無影響.值得一提的是，反 -9，順 -11共軛亞油酸(CLA)有提高C2C12細胞增殖的作用，而其異構體反-10，順 -12 CLA 的作用則相反［9］.另外，順式UFA以及OA和LA等也能促進離體培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的增殖［10-11］.提示UFA對肌肉細胞增殖具有調節(jié)作用，且其生理調節(jié)活性可能與不飽和鍵的數(shù)目和位置有關.本試驗研究結果表明，在體積分數(shù)為10%胎牛血清DMEM或無血清DMEM/F12中添加10.0 μmol/L SA，對C2C12細胞的增殖均有促進作用.這與前人關于UFA對肌肉細胞增殖的研究結果基本一致，并且似乎可以解釋SA促進斷奶仔豬生長發(fā)育的現(xiàn)象.而且前期試驗結果表明SA對斷奶仔豬的促生長作用主要是通過提高肝細胞IGF-1的表達和分泌實現(xiàn)的［4］.

3.2 SA對C2C12細胞GH/IGF系統(tǒng)表達的調節(jié)作用

為了避免血清中大量生長因子的干擾，本試驗采用無血清培養(yǎng)的方式研究SA對C2C12細胞IGF-1分泌的時間和劑量效應.本研究結果表明，隨著SA濃度的升高，C2C12細胞上清IGF-1的濃度先下降，再恢復到原來的水平，然后再一次下降.當SA濃度高于100.0 μmol/L時，我們觀察到無血清培養(yǎng)的C2C12細胞狀態(tài)和活性均受到明顯影響，提示100.0 μmol/L SA組的IGF-1質量濃度顯著下降，可能與細胞狀態(tài)和活性不佳有關.有趣的是，與對照組相比，1.0 μmol/L SA組C2C12細胞上清液中IGF-1的質量濃度顯著降低，而其mRNA表達無顯著改變.Coleman等［12］研究表明，肥育豬肌肉注射豬重組GH顯著提高肝臟和皮下脂肪IGF-1 mRNA的表達，但對肌肉IGF-1 mRNA 表達無影響.Gayan-Ramirez等［13］研究表明，膽汁性肝硬變抑制肝臟IGF-1的表達，但對肌肉組織則無影響.在機體中肝細胞分泌的IGF-1大部分進入血清，然后輸送到各個組織器官發(fā)揮其生理調節(jié)作用［14］，而肌肉細胞產(chǎn)生的IGF-1主要通過自分泌和旁分泌的方式起作用［15］.因此，提示IGF-1在肝臟和肌肉組織中可能存在不同的表達調節(jié)模式.

IGF-1R是一種在質膜中發(fā)現(xiàn)的受體酪氨酸激酶，具有傳遞細胞生存和增殖信號的作用，是IGF-1發(fā)揮生物學功能的主要介導者［16］.近年研究表明，PUFA(CLA、ALA和LA)對IGF-1R的表達有調節(jié)作用［17-18］.而且，SA(100.0 μmol/L)也能顯著提高離體培養(yǎng)的肝細胞(6 h)IGF-1R mRNA的表達［4］.本研究結果表明，1.0 μmol/L SA處理C2C12細胞3 d后可以顯著上調IGF-1R mRNA表達.提示IGF-1R可能介導SA的促C2C12細胞增殖作用，同時IGF-1R表達的提高可能更多結合IGF-1，從而導致上清IGF-1含量的降低，但這有待試驗證實.另外，SA對肝細胞GHR和IGFBP3 mRNA表達均無顯著影響［4］.而本研究結果表明，1.0 μmol/L SA顯著上調GHR mRNA的表達，對IGFBP3 mRNA的表達量也有提高的趨勢.這提示SA對GH/IGF系統(tǒng)表達的調節(jié)作用可能具有組織特異性.

3.3 SA對C2C12細胞糖脂代謝相關基因表達的影響

丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4)在糖代謝中具有重要作用，是一定生理條件下將能量來源從糖向脂肪轉換的關鍵酶［19］.Xu 等［20］研究表明，胰腺 β 細胞培養(yǎng)基中添加高水平的棕櫚酸和葡萄糖能夠分別上調和下調PDK4 mRNA的表達.GLUT 4是骨骼肌細胞中主要的葡萄糖轉運載體，其介導的葡萄糖轉運是骨骼肌糖代謝的主要限速步驟［21］.本試驗結果表明，1.0 μmol/L SA有提高 C2C12細胞PDK4 mRNA表達量的趨勢，對GLUT4 mRNA表達無顯著影響.因此，提示SA在糖代謝中可能更多是影響葡萄糖的有氧氧化，而不是葡萄糖的攝取和轉運.

肉堿棕櫚酰轉移酶1b(CPT1b)是脂肪酸氧化過程中的一種限速酶，位于線粒體外膜，能夠催化長鏈脂肪酸(C10～C18)轉運至線粒體基質進行β氧化，在能量代謝中具有重要作用［22］.其中，長鏈脂肪酸可以通過PPAR激活肌肉CPT1的表達［23］，或者呈劑量依賴地上調離體培養(yǎng)肝細胞CPT1 mRNA的表達［24］，從而增加脂肪酸的氧化.本研究結果表明，無血清培養(yǎng)中添加1.0 μmol/L SA能顯著上調C2C12細胞CPT1 mRNA的表達.近年研究證實，CPT1基因的調節(jié)區(qū)域上存在PPAR反應元件［25］，提示脂肪酸激活CPT1的轉錄可能是通過PPAR進行調節(jié)的.

PGC1α是最初由Puigserver等［26］在小鼠體內發(fā)現(xiàn)的核激素受體PPARγ的轉錄輔激活因子，在線粒體的生成、脂肪酸的β氧化及肝糖異生等過程中有重要作用.研究表明，PGC1α與PPARα協(xié)同調節(jié)線粒體脂肪酸β氧化酶的轉錄［27］.PGC1α通過子宮內膜雌激素受體α(EERα)共激活PDK4的表達，從而調節(jié)葡萄糖代謝［28］.染色體免疫共沉淀試驗也表明PGC1α 可以直接結合在 PDK4的啟動子區(qū)［29］.另外，在C2C12肌管中過表達PGC1α可以誘導PDK4的表達，從而導致葡萄糖的氧化率降低［28］.本研究結果表明，1.0 μmol/L SA處理 C2C12細胞對 PGC1α mRNA表達量有提高的趨勢，提示PGC1α可能介導了SA上調PDK4和CPT1b mRNA表達，從而抑制葡萄糖利用和促進脂肪酸氧化，但這有待進一步研究證實.

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