人防御素 hβD-3基因在大腸埃希菌中的融合表達

孔 杰，曾 珍，吳志偉，褚 夢，趙亞華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

防御素(Defensins)是富含半胱氨酸的陽離子多肽，屬于抗微生物多肽的一族.在體內(nèi)，防御素能夠通過結(jié)構(gòu)性表達和誘導(dǎo)表達分別參與非特異性免疫和特異性免疫反應(yīng).防御素抗菌機制多樣化，它可以通過膜的去極化作用和在膜上形成物理孔洞等多種方式改變細胞膜的通透性［1-2］.根據(jù)前人的研究，目前，防御素分為α、β和θ3類［3］.人防御素只有α和β2種，人 β 防御素3(Human beta defensin 3，hβD-3)具有廣譜的抗菌活性，對多種病原體和一些有耐藥性的微生物都有相當(dāng)?shù)目剐裕?-6］.防御素具有廣泛的抗菌譜，較高的抗菌活性，且免疫原性較低，不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點，從而使其具有廣闊的藥用前景.然而，從天然組織中獲取防御素的難度很大，數(shù)量也很有限.用化學(xué)方法合成的成本很高，且價格昂貴，難以滿足人類的需求.本研究擬以hβD-3為研究對象，設(shè)計了在大腸埃希菌中，采用pET-32a(+)載體以融合的方式表達hβD-3基因.利用載體上的Trx標簽，以期增加所要表達的目的蛋白hβD-3的可溶性.pET-32a(+)載體上帶有的His標簽可以用于鎳離子親和層析［7］，其特異性強，能有效地分離目的蛋白與其他雜蛋白［8-9］.最后利用載體上附有的腸激酶的酶切位點，在完成表達后對融合蛋白進行切割，從而獲得有活性的目的蛋白［10］.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及載體 表達質(zhì)粒pET-32a(+)、克隆菌株 Escherichia coli DH5α、表達菌株 E.coli BL21(DE3)均購自英韋創(chuàng)津生物科技公司，抗菌活性檢測菌株E.coli K12D31購自中國科學(xué)院廣東省微生物研究所菌種室，并由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究室保存.

1.1.2 主要儀器 DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)、5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf)、5415D型高速離心機(德國 Eppendorf)、DG-3A微型水平電泳槽(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)、Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad 公司)、WFJ 7200型可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)、LRH-150型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉試驗設(shè)備廠)、PTC100 PCR擴增儀(美國).

1.1.3 主要試劑 基因工程分子操作用酶:NdeⅠ、NcoⅠ、Taq酶、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司，重組腸激酶(Recombined enterokinase)購自Novagen公司.dNTPs、DL2000 DNA marker、瓊脂糖、RnaseA購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，Tryptone、Yeast Extract為Oxid公司產(chǎn)品，質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自TianGen公司.PCR引物由廣州英駿生物有限公司合成，PVDF Membrane Filter Paper Sandwich和ProBond Purification System均購自Invitrogen公司.其余常用試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.

1.1.4 引物 根據(jù)NCBI上查得hβD-3多肽序列并推繹設(shè)計出 hβD-3全基因的核苷酸序列，再根據(jù)hβD-3全基因序列設(shè)計引物:PⅠ-1，5'-ATCATATGGGTATCATCATCAACATCTTCAGAAATACTACTGCCGTGTTCGTGGTGG-3';PⅠ-2，5'-GGCACAAGCACCACCAGCAACGCGACAAGACTCGACGGACGGCTTTCTTCTTG-TC-3';PⅠ-3，5'-CCGAAAGAAGAAGAACAGATCGGTAAATGCAGCACTCGTGGTCGTAAATGCTGCCGTC-3';PⅠ-4，5'-CATTTACGACGGCAGCATTCTTCACTTCCTCCGGTACCCG-3'.預(yù)期擴增 hβD-3，同時，根據(jù)pET載體中的T7啟動子序列，設(shè)計了用于檢測外源基因是否重組進入pET-32a(+)的檢測引物Ⅰ:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'.

1.2 方法

1.2.1 hβD-3基因片段的擴增 hβD-3基因擴增按PCR試劑盒說明書操作.PCR擴增條件為:94℃ 變性2 min;按94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s共進行25個循環(huán)，最后72℃ 延伸2 min.用20 g/L瓊脂糖電泳檢測PCR結(jié)果.

1.2.2 重組載體pET-32a(+)-hβD-3的構(gòu)建 取pET-32a(+)50 μL，加入 1 μL NdeⅠ、1 μL NcoⅠ、8 μL 10 ×Buffer K、8 μL 10 × BSA 和 12 μL ddH2O;再取 20 μL 的 hβD-3PCR 產(chǎn)物，加入 1 μL NdeⅠ、1 μL NcoⅠ、4 μL 10 × Buffer K、3 μL 10 × BSA 和 11 μL ddH2O;都置于37℃下酶切過夜后，加入10×Loading buffer終止反應(yīng).取PCR管，按1 μL T4DNA連接酶、1 μL 10 ×T4DNA 連接酶緩沖液、2 μL 酶切回收pET-32a(+)、1 μL 酶切回收 hβD-3 和 5 μL ddH2O的配制連接反應(yīng)體系，混勻，16℃放置過夜，將重組子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞.挑取白色菌落接種于3 mL含氨芐西林(Amp)的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)16 h.

1.2.3 轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定 按以下配方，配制PCR 反應(yīng)液:檢測引物Ⅰ(20 μmol/L)1 μL、hβD-3 1 μL、rTaq(5 U/μL)0.25 μL、10 × PCR buffer 1.5 μL、dNTP mix 1 μL.用滅菌吸頭在固體LB平板上挑取pET-32a(+)與hβD-3基因的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子，在含0.1 mg/mL Amp的LB平板點一下，保種并編號，然后浸泡于PCR反應(yīng)液中并混勻.94℃變性2 min，按94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s共進行25個循環(huán)，最后72℃ 延伸2 min.反應(yīng)完畢后取5 μL進行電泳檢測，PCR結(jié)果陽性菌落委托廣州英駿生物公司進行序列測定.

1.2.4 pET-32a(+)-hβD-3融合蛋白的誘導(dǎo)表達取出在-80℃下凍存的大腸埃希菌表達菌種，接種于4 mL含0.1 mg/mL Amp的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8 h，作為種子液.取250 mL三角瓶，將50 μL種子液接種于50 mL含0.1 mg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩培養(yǎng)至D600nm=0.5～0.6.培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液分裝于2個100 mL三角瓶，每瓶25 mL.其中一瓶加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，另一瓶不加IPTG，同時置于30℃振蕩培養(yǎng)5 h.誘導(dǎo)完畢后，各取1 mL培養(yǎng)液，4 000 r/min 離心 5 min，取沉淀，加入 100 μL 0.1 mol/L pH7.4的PBS緩沖溶液重懸，超聲波破碎細胞，然后12 000 r/min離心15 min，分別取上清(可溶性蛋白部分)及沉淀(不溶性蛋白部分)50 μL，加入5 × SDS loading buffer，沸水浴 10 min，各取 10 μL進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE).將剩余的培養(yǎng)液于4℃ 4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用ddH2O洗沉淀2次，4℃ 4000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用8 mL Native Binding buffer(含 10 mmol/L咪唑)重懸，然后在冰浴下超聲波破碎細胞(工作時間10 s，間隔時間20 s，總工作時間30 min，功率400 W).4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液于4℃下保存?zhèn)溆?

1.2.5 pET-32a(+)-hβD-3融合蛋白的鎳離子親和層析 按照鎳離子親和層析系統(tǒng)說明書裝填層析柱，處理層析樹脂，將上清液注入層析柱，溫和振蕩1 h，靜置層析柱，待樹脂沉淀后吸出上清液，同時收集100 μLSDS-PAGE檢測.在吸去上清后的層析柱中加入8 mL Native wash buffer，振蕩清洗樹脂3次，每次10 min，待樹脂沉淀后吸出上清液，收集上清液100 μL用于 SDS-PAGE檢測.最后加入 Native elution buffer(含400 mmol/L咪唑)5 mL，溫和振蕩30 min洗脫.打開柱塞，使洗脫液流出，流速控制在0.5 mL/min，同樣收集100 μL用于 SDS-PAGE檢測，其余洗脫液于4℃保存?zhèn)溆?

1.2.6 pET-32a(+)-hβD-3融合蛋白的腸激酶酶切將獲得的吸附有pET-32a(+)-hβD-3融合蛋白的層析樹脂用5 mL 1×rEK clearage buffer洗滌3次.打開柱塞，讓洗滌液流出.加入1 mL 1×rEK clearage buffer，然后按照一個酶活力單位為50 μg蛋白的比例加入rEK，24℃下振蕩反應(yīng)15 h，加入終質(zhì)量濃度為1 mg/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應(yīng).離心，上清液即為pET-32a(+)-hβD-3融合蛋白溶液.離心后的層析樹脂加入1 mL Native elution buffer(含400 mmol/L咪唑)溫和振蕩30min洗脫蛋白，靜止30 min，上清即為酶切后的洗脫液.取pET-32a(+)-hβD-3融合蛋白溶液和酶切后洗脫液各20 μL，加入5 μL 5 × SDS loading buffer，沸水浴 10 min，進行Tricine-SDS-PAGE，檢測rEK酶切情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 hβD-3基因的合成及擴增

采用PCR的方法合成hβD-3全基因，經(jīng)過PCR合成與擴增后，擴增片段大小位于150 bp左右，與目的片段151 bp的大小相符.結(jié)果如圖1.

2.2 pET-32a(+)載體的酶切鑒定

圖2中泳道1中的電泳條帶大小約在Hind-ⅢMarker的4 361 bp與6 557 bp之間.與質(zhì)粒pET-32a(+)的理論值大小5 900 bp基本相符，且只有一條泳帶，證明雙酶切是完全的，該電泳條帶是pET-32a(+).

圖1 hβD-3基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of hβD-3 gene of PCR amplification

圖2 pET-32a(+)質(zhì)粒雙酶切分析圖Fig.2 Double enzyme restriction analysis of pET-32a(+)

2.3pET-32a(+)-hβD-3重組子的PCR鑒定

酶切后的hβD-3基因與pET-32a(+)質(zhì)粒經(jīng)連接與轉(zhuǎn)化后，挑取平板上轉(zhuǎn)化后的單菌落，做菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖3.

圖3 pET-32a(+)-hβD-3菌落PCR鑒定Fig.3 Results of pET-32a(+)-hβD-3 recombinant of PCR

由圖3可見，菌落PCR擴增出現(xiàn)1條約700 bp的電泳條帶(如箭頭所指).由于PCR鑒定采用T7 Promoter為5'端引物，用 hβD-3 的 3'末端為 3'端引物，由此擴增出來的目的片段大小為714 bp，這與PCR檢測的結(jié)果相符.

2.4 hβD3基因表達的融合蛋白的表達

hβD3基因表達的融合蛋白(F-βD-3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4.

圖4 F-βD-3融合蛋白誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE analysis of fusion protein F-βD-3 expression induction

由圖4可見，與未加IPTG誘導(dǎo)的對照相比，用1 mmol/L IPTG在30℃誘導(dǎo)表達后的總蛋白在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)蛋白條帶.經(jīng)計算，F(xiàn)-βD-3蛋白的相對分子質(zhì)量為5 100，加上載體上的附加序列約17 200，融合蛋白 F-βD-3的 Mr理論值為 22 300，SDS-PAGE的結(jié)果與該融合蛋白的理論相對分子質(zhì)量基本相符.應(yīng)用凝膠分析軟件Bandscan 5.0分析誘導(dǎo)表達后總蛋白中融合蛋白的含量，F(xiàn)-βD-3蛋白的表達量為57.8%.用考馬斯亮藍G250法測定菌體總蛋白的質(zhì)量濃度為220.12 μg/mL，計算得到融合蛋白F-βD-3的表達量為127.23 μg/mL.

2.5 F-βD-3融合蛋白的鎳柱親和層析

F-βD-3融合蛋白經(jīng)過鎳離子親和層析后，各組分的SDS-PAGE電泳圖如圖5.

由圖5可見，經(jīng)過鎳離子柱親和層析吸附之后的溶液中不含F(xiàn)-βD-3融合蛋白，說明F-βD-3融合蛋白基本上被Ni柱親和層析樹脂所吸附.從洗滌液的電泳結(jié)果可以看到，用含有20 mmol/L咪唑的N-ative washing buffer洗滌雜蛋白，沒有F-βD-3融合蛋白被洗脫.從洗脫液的電泳結(jié)果可見，F(xiàn)-βD-3融合蛋白可被含400 mmol/L咪唑的Native elution buffer洗脫下來，洗脫液中基本不含雜蛋白.經(jīng)考馬斯亮藍G250法測定層析后溶液的總蛋白質(zhì)量濃度為46.72 μg/mL.

圖5 F-βD-3融合蛋白Ni親和層析后各組分的 SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of Ni affinity chromatography of fusion protein F-βD-3

2.6 F-βD-3融合蛋白的腸激酶酶切

F-βD-3融合蛋白用腸激酶酶切后的 Tricine-SDS-PAGE結(jié)果如圖6.

圖6 F-βD-3融合蛋白的rEK酶切Fig.6 Results of rEK restriction of fusion protein F-βD-3

由圖6可見，被rEK酶切后的F-βD-3融合蛋白出現(xiàn)一條相對分子質(zhì)量約為5 000左右的蛋白帶，與hβD-3蛋白的相對分子質(zhì)量基本相符，確認是從F-βD-3融合蛋白中切下的hβD-3.另外在相對分子質(zhì)量為14 400處出現(xiàn)1條新的條帶，為載體上附帶的Trx融合蛋白標簽.經(jīng)考馬斯亮藍G250法測定酶切后的總蛋白質(zhì)量濃度為18.17 μg/mL，可以認為該蛋白的質(zhì)量濃度是最終得到的hβD-3蛋白量.經(jīng)鎳離子柱親和層析與腸激酶切割融合標簽后，目的蛋白hβD-3損失較大.

2.7 重組hβD-3蛋白的抑菌活性鑒定

取經(jīng)腸激酶酶切的重組蛋白hβD-3，用瓊脂糖擴散法進行抑菌試驗，以無菌水為對照，檢測并比較重組蛋白hβD-3對大腸埃希菌K12D31的抑菌活性，瓊脂糖擴散法抑菌測試結(jié)果如圖7.由圖7可見，融合表達的F-βD-3蛋白切割后的產(chǎn)物hβD-3蛋白對大腸埃希菌K12D31均表現(xiàn)出明顯抗性.編號1中50 μL hβD-3蛋白抑菌圈直徑為15.1 mm，編號2中55 μL hβD-3蛋白抑菌圈直徑為15.4 mm，編號3中60 μL hβD-3蛋白抑菌圈直徑為16.3 mm，編號4中65 μL hβD-3蛋白抑菌圈直徑為17.4 mm.隨著hβD-3蛋白質(zhì)含量增加，抑菌性也明顯增強.

圖7 不同體積hβD-3蛋白抑菌圈比較Fig.7 Comparison of different volumes of hβD-3 proteins

3 討論

人β防御素類抗菌肽作用機制獨特，不易使微生物產(chǎn)生耐藥性，并且因其源于機體本身而具有非常高的安全性，因此研究開發(fā)這類抗菌肽對于解決細菌耐藥問題具有重要意義［11］.為了嘗試有效的人β防御素3基因的融合表達路線，使hβD-3基因能夠穩(wěn)定、高效地表達，本研究構(gòu)建了重組的hβD-3的融合基因表達載體 pET-32a(+)-hβD-3.pET-32a(+)載體在緊鄰啟動子的下游位置，包含有溶解性高，且能促二硫鍵正確折疊的多肽序列融合標簽(如Trx·Tag)，純化標簽(如 His·Tag)，這些標簽都能夠促進外源基因的有效表達［12-13］.研究中融合表達使用的載體為pET-32a(+)，載體帶有His·Tag，可以簡便地用于鎳離子親和層析，而且特異性強，簡化了下游純化步驟.此外，載體提供的腸激酶酶切位點，使完成親和層析后的蛋白能用腸激酶將融合片段完全切除.應(yīng)用pET-32a(+)載體在BL21(DE3)溶原菌中進行了F-βD-3蛋白的融合表達，表達量達到127.23 μg/mL.融合蛋白經(jīng)鎳柱親和層析［13］與腸激酶酶切后，有一定損失，最終得到hβD-3蛋白的量為18.17 μg/mL.對大腸埃希菌K12D31的抑菌試驗鑒定表明，hβD-3蛋白均為有活性的重組蛋白，且隨著hβD-3蛋白質(zhì)含量的增加，抑菌的效果更加明顯.

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