植物精油對(duì)魚藤酮和辣椒堿在斜紋夜蛾離體培養(yǎng)細(xì)胞系SL-1中活性的影響

溫好菊，宋香寧，張志祥，程?hào)|美，張清鵬

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510642;2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣東廣州510225)

植物精油是一類植物源次生代謝物質(zhì)，通過蒸餾、浸提、壓榨等方法從含精油的植物中分離提取得來的油狀液體物質(zhì)［1］，組成成分多為醇類、醛類、萜烯類化合物，其揮發(fā)性高，滲透性強(qiáng)，對(duì)水溶性和脂溶性藥物均有強(qiáng)促滲活性.因此，在醫(yī)藥上被用作藥物的透皮吸收促進(jìn)劑，如:肉桂油、丁香油、桉葉油、薄荷油、蒼術(shù)油、廣藿香油等［2-4］.王慶偉等［5］以預(yù)處理的體外兔皮膚作為滲透屏障，F(xiàn)ranz擴(kuò)散池進(jìn)行體外滲透試驗(yàn)，研究結(jié)果表明φ為1%的當(dāng)歸油能夠促進(jìn)脂溶性藥物尼莫地平透皮吸收，與對(duì)照相比，尼莫地平吸收速率提高3.25倍.此外，φ為2%的丁香油對(duì)5-氟尿嘧啶促透效果優(yōu)于高效的化學(xué)促透劑氮酮［6］.

滲透劑是具有促進(jìn)有效組分滲透到靶體內(nèi)部或增強(qiáng)藥劑透過處理表面進(jìn)入生物體內(nèi)部能力的助劑，本身不具毒性，能與多種殺蟲劑配合使用，提高農(nóng)藥在害蟲表面的滲透能力，充分發(fā)揮殺蟲劑的生物活性，降低農(nóng)藥用量，對(duì)作物和天敵安全.植物精油在農(nóng)業(yè)病蟲害的綜合治理方面得到較為廣泛應(yīng)用，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球已商品化精油類農(nóng)藥年產(chǎn)量在45 000 t左右，銷售額700萬(wàn)美元［7］，植物精油本身對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲和儲(chǔ)糧害蟲具有觸殺、拒食、驅(qū)避、產(chǎn)卵、趨避作用和生長(zhǎng)抑制活性［8］.除了精油本身具有良好的生物活性外，已有研究證明精油對(duì)殺蟲劑具有明顯的增效作用，土荊芥精油能夠增加小菜蛾和家蠅對(duì)氟蟲腈的敏感性［9］;側(cè)柏精油和松針精油增加氟蟲腈透皮吸收量，從而提高藥效［10］;肉豆蔻醚是氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效增效劑，細(xì)辛醚能夠增加煙堿的殺蟲活性［11］;黃樟油的主要成分黃樟油素的衍生物，是除蟲菊素類殺蟲劑的增效劑，可以提高殺蟲劑藥效10～15倍.滲透劑作為一種農(nóng)藥增效劑，在提高農(nóng)藥的藥效、降低農(nóng)藥施用量、減少其對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染和對(duì)人體的毒害方面有著十分顯著的作用，但是有關(guān)植物精油作為天然促透劑應(yīng)用于農(nóng)藥領(lǐng)域的報(bào)道較少.

利用離體昆蟲細(xì)胞代替活體進(jìn)行毒力測(cè)定是一種直接反映化合物毒性作用的檢測(cè)方法，本研究以斜紋夜蛾Spodoptera litura離體培養(yǎng)細(xì)胞系(SL-1細(xì)胞)為供試細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究了24種植物精油對(duì)SL-1細(xì)胞細(xì)胞膜電位和細(xì)胞膜通透性的影響，從中篩選出5種對(duì)SL-1細(xì)胞細(xì)胞膜通透性影響顯著的植物精油，研究其對(duì)魚藤酮和辣椒堿細(xì)胞活性的影響，為植物精油在增加殺蟲劑滲透性、提高藥效方面的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SL-1細(xì)胞系:斜紋夜蛾離體培養(yǎng)卵巢細(xì)胞系，引自華中師范大學(xué)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng).培養(yǎng)基為添加質(zhì)量比為8%新生胎牛血清的Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，27℃恒溫培養(yǎng).

1.2 供試藥劑及儀器

97% 辣椒堿(Capsaicin)，河南倍特生物科技有限公司;96.8% 魚藤酮(Rotenone)，廣州市益農(nóng)生化有限公司;植物精油，江西省吉水康神天然藥用油提煉廠，種類及來源見表1;供試藥品用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成母液，處理細(xì)胞前用培養(yǎng)基稀釋，保持DMSO最終體積分?jǐn)?shù)為0.5%;5 mg·mL-13-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)溶液:稱取50.0 mg MTT，加10 mL磷酸緩沖液 (PBS)，待完全溶解后，0.22 μm濾膜過濾，置 4℃冰箱中待用;Bis-(1，3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol［DiBAC4(3)，美國(guó) Invitroge公司］工作液:準(zhǔn)確稱取DiBAC4(3)1 mg，加入無水乙醇 1 mL，配成 1 mg·mL-1母液，-20℃條件凍存，使用前取0.25 mL母液加入PBS至50 mL，使其質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1;碘化丙啶(PI)試劑盒，美國(guó)Becton Dickinson公司;H80-2型低速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)Becton Dickinson公司;Plus酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-RAD公司生產(chǎn).

1.3 DiBAC4(3)染色檢測(cè)SL-1細(xì)胞膜電位的變化

［12］方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SL-1細(xì)胞以1.0×105/mL密度接種于培養(yǎng)皿(直徑60 mm)內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入100 μg·mL-1植物精油處理SL-1細(xì)胞，以φ為0.5%DMSO培養(yǎng)基為對(duì)照.藥物處理24 h后收集細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌、離心2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/mL，DiBAC4(3)染色，27℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀FL1通道檢測(cè)熒光強(qiáng)度，每處理設(shè)3次重復(fù)，以φ為70%的乙醇處理1 h作為陽(yáng)性對(duì)照.

表1 供試植物精油名錄Tab.1 List of essential oils:common name

1.4 PI單染檢測(cè)SL-1細(xì)胞細(xì)胞膜通透性變化

參考文獻(xiàn)［13］方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SL-1細(xì)胞以1.0×105mL-1密度接種于培養(yǎng)皿 (直徑60 mm)內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入50和100 μg·mL-1植物精油處理 SL-1細(xì)胞，以 φ為0.5%DMSO培養(yǎng)基為對(duì)照.孵育24 h后收集細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106mL-1，PI染色，27℃避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀FL2通道檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PI熒光強(qiáng)度，每處理設(shè)3次重復(fù)，以φ為70%乙醇處理1 h作為陽(yáng)性對(duì)照.

1.5 細(xì)胞毒力測(cè)定

采用MTT法測(cè)定植物精油對(duì)魚藤酮和辣椒堿的細(xì)胞毒性的影響［14-16］.于96孔板加入100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SL-1細(xì)胞細(xì)胞懸浮液 (細(xì)胞密度約為1.0×105mL-1)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥劑處理.魚藤酮和辣椒堿母液用無血清Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成5個(gè)濃度梯度，將藥液分別與預(yù)先配制好的廣藿香油、松節(jié)油、蕓香油、當(dāng)歸油、香茅油溶液等比混合，使精油在各濃度藥液中的質(zhì)量濃度分別為50和100 μg·mL-1，以相同用量的植物精油DMSO溶液為對(duì)照.每處理5次重復(fù)，待藥劑處理20 h后，每孔加入5 mg·mL-1的 MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h.棄去上清液，再向每孔加入100 μL DMSO，室溫孵育30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的光密度.根據(jù)光密度計(jì)算細(xì)胞的毒力，以單獨(dú)的精油處理為對(duì)照，計(jì)算藥劑+精油處理的校正死亡率和抑制中濃度(IC50).

1.6 數(shù)據(jù)處理

毒力回歸、方差分析均采用SAS數(shù)據(jù)軟件分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan’s multiple range test，DMRT)進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 24種植物精油處理對(duì)SL-1細(xì)胞膜電位的影響

DiBAC4(3)是一種膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，根據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)外的重新分布可以判斷細(xì)胞膜電位的變化.當(dāng)DiBAC4(3)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)減少時(shí)，熒光強(qiáng)度降低，表明細(xì)胞膜電位負(fù)值增加，細(xì)胞膜出現(xiàn)超極化，反之細(xì)胞膜去極化.從表2中可以看出，φ為70%乙醇處理后，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜電位瓦解，DiBAC4(3)的平均熒光強(qiáng)度 (MIF)值增加，與對(duì)照相比MIF值增加23.80%，杏仁油、薰衣草油同樣引起細(xì)胞膜電位去極化，MIF值分別增加21.97%和13.60%.其余處理均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DiBAC4(3)的熒光強(qiáng)度降低，表明精油處理后引起細(xì)胞膜電位超極化，廣藿香油、月見草油、松節(jié)油、蕓香油、山蒼子油、當(dāng)歸油、香茅油和生姜油8種植物精油處理后MIF值顯著下降，與對(duì)照相比MIF值下降了20%以上，其中廣藿香油、月見草油、松節(jié)油、蕓香油、山蒼子油處理后，MIF下降率分別為:64.96%、41.44%、56.79%、41.99%、41.22%，顯著高于其他處理.檸檬油、留蘭香油、樟腦油和茶樹油處理后，細(xì)胞膜電位變化不顯著.

表2 植物精油對(duì)SL-1細(xì)胞膜電位的影響1)Tab.2 Effects of commercial essential oils on membrane potential of SL-1 cells

2.2 植物精油處理對(duì)SL-1細(xì)胞膜通透性的影響

PI為大分子熒光染料，不能透過正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，但是當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞死亡時(shí)，PI可以自由通過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)核膜結(jié)合，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度(MIF)的大小可以反映細(xì)胞膜通透性的變化.研究了50和100 μg·mL-1植物精油處理SL-1細(xì)胞后，細(xì)胞膜對(duì)熒光染料PI通透性變化，結(jié)果見表3.φ為70%乙醇處理后，細(xì)胞膜完整性完全破壞，PI可以自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA、RNA結(jié)合，與空白對(duì)照相比，MIF值增加91.76%，50 μg·mL-1精油處理SL-1細(xì)胞24 h后，與對(duì)照相比精油處理細(xì)胞內(nèi)PI的MIF值明顯增加.蕓香油處理SL-1細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性影響最顯著，細(xì)胞內(nèi)MIF值增強(qiáng)了53.04%，但低于陽(yáng)性對(duì)照，其次是松節(jié)油和當(dāng)歸油，分別為:34.23% 和 33.67%.100 μg·mL-1精油處理后，細(xì)胞膜對(duì)PI的通透性均增加，細(xì)胞內(nèi)PI的MIF值增加超過40%的處理有:廣藿香油、松節(jié)油、蕓香油、當(dāng)歸油、香茅油和生姜油.其中 100 μg·mL-1蕓香油、廣藿香油和松節(jié)油處理后，SL-1細(xì)胞膜通透性變化最顯著，細(xì)胞膜對(duì)PI的通透率分別增強(qiáng)了83.38%、58.41%和58.25%，蕓香油處理后細(xì)胞內(nèi)MIF值與φ為70%乙醇處理差異不顯著.

2.3 植物精油對(duì)魚藤酮、辣椒堿的細(xì)胞活性的影響

綜合比較24種植物精油對(duì)細(xì)胞膜電位和細(xì)胞膜完整性的影響，其中廣藿香油、蕓香油、香茅油、當(dāng)歸油、松節(jié)油5種植物精油能夠顯著增加細(xì)胞膜的通透性.以魚藤酮和辣椒堿為模式藥物，采用MTT法研究植物精油對(duì)魚藤酮、辣椒堿的細(xì)胞活性的影響.

2.3.1 植物精油對(duì)魚藤酮的細(xì)胞活性的影響 魚藤酮及魚藤酮與植物精油聯(lián)用對(duì)SL-1細(xì)胞的增殖抑制活性見表4，魚藤酮處理SL-1細(xì)胞24 h后，IC50為34.97 μg·mL-1，當(dāng)魚藤酮系列質(zhì)量濃度溶液中分別含有50 μg·mL-1的松節(jié)油、蕓香油、香茅油時(shí)對(duì)魚藤酮的細(xì)胞活性影響顯著(IC5095%置信區(qū)間沒有交叉)，達(dá)到相同的抑制率混劑中魚藤酮的用量?jī)H為 14.03、18.02、26.86 μg·mL-1，魚藤酮單劑與混劑的IC50比值分別為 2.49、1.30、1.94，低質(zhì)量濃度廣藿香油、當(dāng)歸油對(duì)魚藤酮的細(xì)胞活性影響不顯著(IC5095%置信區(qū)間有交叉).當(dāng)植物精油增加至100 μg·mL-1時(shí)，廣藿香油、松節(jié)油、蕓香油、當(dāng)歸油和香茅油與魚藤酮聯(lián)用的IC50分別為25.42、14.56、12.69、21.72、23.41 μg·mL-1，均小于魚藤酮單劑，魚藤酮單劑與混劑的 IC50比值分別為1.38、2.76、1.49、1.61、2.40，這表明 5 種精油在 100 μg·mL-1時(shí)，顯著增加了魚藤酮對(duì)SL-1細(xì)胞的細(xì)胞活性(IC5095%置信區(qū)間沒有交叉).

2.3.2 植物精油對(duì)辣椒堿細(xì)胞活性的影響 廣藿香油、蕓香油、香茅油、當(dāng)歸油、松節(jié)油5種植物精油與辣椒堿聯(lián)用時(shí)對(duì)SL-1細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果見表5.辣椒堿單劑處理SL-1細(xì)胞24 h后，IC50為

35.92 μg·mL-1，當(dāng)辣椒堿系列濃度溶液中分別含有50 μg·mL-1的廣藿香油、蕓香油、松節(jié)油時(shí)，IC50分別為 28.91、28.08、19.60 μg·mL-1，均顯著低于辣椒堿單劑，低濃度香茅油和當(dāng)歸油對(duì)辣椒堿的細(xì)胞活性影響不顯著.100 μg·mL-1上述5種植物精油與辣椒堿聯(lián)用后 IC50分別為:14.56、13.26、33.86、24.10、11.39 μg·mL-1，均低于辣椒堿單劑，其中廣藿香油、蕓香油、松節(jié)油在100 μg·mL-1時(shí)能夠顯著提高辣椒堿的細(xì)胞活性(IC5095%置信區(qū)間沒有交叉)，其 IC50分別為:14.56、13.26和 11.39 μg·mL-1，辣椒堿單劑與混劑的 IC50比值分別為2.47、2.71、3.15.

表3 植物精油處理對(duì)SL-1細(xì)胞質(zhì)膜通透性的影響1)Tab.3 Effects of commercial essential oils on membrane integrity of SL-1 cells

表4 魚藤酮及魚藤酮與植物精油聯(lián)用對(duì)SL-1細(xì)胞的增殖抑制活性Tab.4 Inhibition of rotenone and the combination with essential oils on the proliferation of Sl-1 cells

表5 辣椒堿及辣椒堿與植物精油聯(lián)用對(duì)SL-1細(xì)胞的增殖抑制活性Tab.5 Inhibition of Capsaicin and the combination with essential oils on the proliferation of Sl-1 cells

3 討論

植物精油作為中藥滲透促進(jìn)劑在醫(yī)藥上應(yīng)用廣泛.此外，植物精油殺菌作用機(jī)理的研究表明:精油能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜磷酸雙分子結(jié)構(gòu)［17］，破壞膜蛋白，導(dǎo)致胞內(nèi)成分滲出、消耗分子主動(dòng)運(yùn)輸力［18］，最終起到殺菌的作用.植物精油對(duì)表皮細(xì)胞和質(zhì)膜都具有良好的增透作用，精油作為滲透劑應(yīng)用于殺蟲劑助劑方面，使其很快在蟲體內(nèi)達(dá)到有效劑量并盡快到達(dá)作用靶標(biāo)，從而引起害蟲中毒死亡［19］.由于精油本身低毒甚至無毒，所以精油與殺蟲劑混用有利于降低農(nóng)藥毒性，對(duì)作物和天敵安全.本文以離體培養(yǎng)的SL-1細(xì)胞為研究對(duì)象，初步研究了24種植物精油對(duì)SL-1細(xì)胞膜的影響.研究結(jié)果表明:100 μg·mL-1的廣藿香油、月見草油、松節(jié)油、蕓香油、山蒼子油、當(dāng)歸油、香茅油和生姜油8種植物精油處理致使SL-1細(xì)胞的細(xì)胞膜電位超極化，這與大多數(shù)研究相反，這可能與所用的熒光染料和精油濃度有關(guān).本研究所用DiBAC4(3)為脂溶性的陰離子型慢反應(yīng)熒光探針，在膜電勢(shì)的作用下能自由通過正常細(xì)胞質(zhì)膜，但是DiBAC4(3)本身沒有熒光，必須與細(xì)胞質(zhì)中蛋白結(jié)合后才能夠發(fā)熒光［20］.因此，DiBAC4(3)熒光強(qiáng)度的變化不僅與細(xì)胞膜電位有關(guān)，還與細(xì)胞質(zhì)中可結(jié)合的蛋白質(zhì)的量有關(guān)，本試驗(yàn)中大多數(shù)精油處理后DiBAC4(3)熒光強(qiáng)度降低，可能是精油處理的濃度過高或時(shí)間過長(zhǎng)，抑制了有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，具體原因有待進(jìn)一步研究.為了進(jìn)一步證明精油對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，利用熒光染料PI的膜不通透性，來分析精油對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響.低劑量精油處理后，與對(duì)照相比，大部分精油處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，其中蕓香油能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)PI的熒光強(qiáng)度，其次是當(dāng)歸油、松節(jié)油.當(dāng)精油質(zhì)量濃度增至100 μg·mL-1時(shí)，廣藿香油、松節(jié)油、蕓香油、當(dāng)歸油、香茅油、生姜油處理SL-1細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增值超過40%.說明植物精油處理后能夠破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞膜的選擇通透性消失，大分子熒光染料PI可自由進(jìn)入細(xì)胞，精油對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響與精油質(zhì)量濃度成正相關(guān).

魚藤酮和辣椒堿是目前已經(jīng)商品化應(yīng)用的植物源殺蟲劑，兩者對(duì)害蟲都具有良好的觸殺活性，然而內(nèi)吸性較差，能否更多地穿透害蟲表皮將影響藥劑對(duì)害蟲的毒力［21-22］，本試驗(yàn)從24種植物精油中篩選出廣藿香油、松節(jié)油、蕓香油、當(dāng)歸油和香茅油5種植物精油分別與魚藤酮、辣椒堿聯(lián)用，評(píng)價(jià)精油對(duì)2種植物源農(nóng)藥的細(xì)胞活性的影響.研究結(jié)果表明，100 μg·mL-1的廣藿香油、松節(jié)油、蕓香油、當(dāng)歸油、香茅油5種植物精油分別與魚藤酮和辣椒堿聯(lián)用后，IC50均低于魚藤酮和辣椒堿單用，表明供試5種植物精油均能在一定程度提高2種植物源農(nóng)藥對(duì)SL-1細(xì)胞的細(xì)胞活性;50 μg·mL-1的松節(jié)油、蕓香油對(duì)魚藤酮和辣椒堿的細(xì)胞活性影響顯著，50 μg·mL-1的松節(jié)油和蕓香油與魚藤酮聯(lián)用，達(dá)到50%的抑制率時(shí)混劑中魚藤酮的用量?jī)H為魚藤酮單獨(dú)使用時(shí)的52%和40%;松節(jié)油和蕓香油同樣能夠提高辣椒堿的細(xì)胞活性，達(dá)到50%的抑制率時(shí)混劑中辣椒堿的用量?jī)H為辣椒堿單獨(dú)使用時(shí)的55%和78%.

殺蟲劑的藥效一方面取決于有效成分的毒性大小，另一方面則取決于穿透生物體表和細(xì)胞膜，到達(dá)作用位點(diǎn)的難易程度.本研究表明，松節(jié)油、蕓香油能夠破壞細(xì)胞膜的完整性，增加通透性，并對(duì)魚藤酮和辣椒堿的細(xì)胞活性均有顯著提高.因此推論，蕓香油、松節(jié)油應(yīng)用于殺蟲劑的助劑中，有利于提高農(nóng)藥防治效果，減少農(nóng)藥用量，對(duì)降低農(nóng)藥殘留和保護(hù)環(huán)境具有重要的意義.但是關(guān)于蕓香油、松節(jié)油對(duì)魚藤酮和辣椒堿的增效活性，有待進(jìn)一步活蟲試驗(yàn)驗(yàn)證.

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