他克莫司血藥濃度監(jiān)測中質(zhì)控分析評價

郝堂娜，孫 玲，李 鎮(zhèn)，張 寧，張 策，聶維廷

他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K506)是日本藤澤研發(fā)的23元環(huán)狀大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，通過拮抗相關(guān)多細胞因子的產(chǎn)生和表達來抑制T細胞活化［1-2］，具有急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低、對類固醇激素相對無依賴性等優(yōu)點。但其治療窗窄，生物利用度個體差異大，同時存在很多不良反應(yīng)［3-4］，因此，對FK506進行治療藥物監(jiān)測(TDM)非常必要［5-6］。本文采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行血藥濃度測定，并對2007年6月-2010年7月FK506血藥濃度監(jiān)測過程中的隨行質(zhì)控數(shù)據(jù)進行回顧性分析，確保他克莫司血藥濃度測定結(jié)果的準確性。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 PRO-TracⅡTMTacrolimus ELISA試劑盒(美國 Diasorin公司生產(chǎn)):①酶標板;②FK506單克隆抗體;③5×濃縮辣根過氧化酶儲存液;④酶標稀釋液;⑤標準品(濃度分別為:0.3、1.0、3.0、10、30 ng/mL);⑥低、高質(zhì)控對照品1、2;⑦底物液;⑧終止液;⑨10×洗滌液;⑩消化液。

1.2 儀器 酶標儀(美國Universal Microplae Reader EL×800NB)，Adoff管(江蘇海門天星塑料制品廠)，HH-W21-420S數(shù)顯電熱顯溫水溫箱，SK-1快速混勻器(江蘇醫(yī)療儀器廠)，LG15-W 離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，他克莫司定量測定試劑盒(酶聯(lián)免疫法，美國Diasorin公司)，低速自動平衡離心機 LDZ5-2(北京醫(yī)用離心機廠)，Stat Fax-2200孵育振蕩儀(美國Awareness公司)。

2 方法

2.1 標準曲線的建立 建立5個點的標準曲線，標 準 品 濃 度 分 別 為 0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 ng/mL，并隨行兩個濃度質(zhì)控樣品 2.0、15.0 ng/mL。取標準系列樣品、質(zhì)控對照樣品各25μL放入1.5mL Adoff管，加入150μL 消化液，渦旋30 s，室溫下靜置15min，然后放入75℃水浴箱中靜置15min。取出渦旋30 s，4500 r/min離心10min，分別取上清液100μL加入酶標板，除空白對照管外，每管加50μL FK506單抗，空白對照管加50μL酶標稀釋液，用薄膜覆蓋酶標板放入溫育震蕩器，(700±50)r/min置37℃震蕩30min。取出加酶標液50μL(用酶標稀釋液5倍稀釋酶標濃縮液)，震蕩60min(條件同前)。取出洗板3次(用蒸餾水將洗滌緩沖液按1∶10稀釋)，然后每管加200μL底物液，震蕩15min(條件同前)。再加入100μL終止液，在450/630 nm下測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制吸光度對濃度的標準曲線［7］。

2.2 FK506質(zhì)控樣品血藥濃度測定 監(jiān)測全血中FK506血藥濃度，同時監(jiān)測低、高兩個質(zhì)控樣本濃度 C1、C2(ng/mL)，測定方法同“2.1”項方法。

2.3 數(shù)據(jù)分析方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件分別對2007年6月-2010年7月期間的質(zhì)控數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，并繪制質(zhì)控曲線。

2.4 繪制質(zhì)控圖和設(shè)定控制限 在監(jiān)測臨床樣品血藥濃度同時隨行質(zhì)控測定，并記錄結(jié)果。以2007年6月-2010年7月監(jiān)測質(zhì)控的單次測定結(jié)果為研究對象，對獲得的FK506低、高濃度質(zhì)控測定結(jié)果C1、C2(ng/mL)進行回顧性分析，計算出平均值(X)、標準差(SD)和相對標準偏差(RSD)。以X為靶值，SD的倍數(shù)為控制限，即質(zhì)控品測定值在X±2SD之間為質(zhì)控結(jié)果在控，以X±2SD為警告限、X±3SD為失控限。以靶值為中心線，以測定批次為橫坐標，以濃度測定結(jié)果為縱坐標，標出各條控制限，繪制FK506血藥濃度監(jiān)測的Levey-Jennings質(zhì)控圖。

3 結(jié)果

3.1 標準曲線的繪制 以吸光度對濃度進行線性回歸，得標準曲線 Y=1.9668/［1+(X/3.697)^1.381］+0.4602，r=0.9996，如圖1 所示。FK506在0.3～30μg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 酶聯(lián)免疫吸附法測定FK506標準曲線

3.2 統(tǒng)計學分析結(jié)果 對2007年6月-2010年7月隨行低、高質(zhì)控的單次測定結(jié)果分別進行單向方差檢驗。結(jié)果表明，在不同時間段內(nèi)對低質(zhì)控的測定結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而對高質(zhì)控的測定差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，結(jié)果見表1。

表1 2007年6月-2010年7月高、低質(zhì)控處理結(jié)果

3.3 levey-Jennings質(zhì)控圖分析結(jié)果 2007年6月-2010年 7月測得質(zhì)控 269份，其中 C1(2.0 ng/mL)134份，C2(15 ng/mL)135份，質(zhì)控周期內(nèi)隨行質(zhì)控樣本RSD分別為3.85%、4.89%、4.80%。繪制單濃度Levey-Jelmings質(zhì)量控制圖，測定結(jié)果均“在控”，結(jié)果見表2。低濃度質(zhì)控誤差允許范圍(X±2SD)為1.15～3.29 ng/mL，測定值范圍為1.72～2.63 ng/mL，而高濃度質(zhì)控誤差允許范圍(X±2SD)為10.50～21.55 ng/mL，測定值范圍為13.92～17.10 ng/mL，可見高、低質(zhì)控均在質(zhì)控警告限范圍內(nèi)，結(jié)果見圖2、圖3。

表2 Levey-Jelmings質(zhì)控圖與標準質(zhì)控范圍結(jié)果比較

圖2 質(zhì)控C1(ng/mL)濃度Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖3 質(zhì)控C2(ng/mL)濃度Levey-Jennings質(zhì)控圖

4 討論

4.1 FK506藥物濃度監(jiān)測方法的選擇 FK506在全血中分布遠遠高于血漿，因此，測定FK506全血血藥濃度檢測靈敏度高，結(jié)果更可靠。目前，F(xiàn)K506全血血藥濃度測定的常用方法有ELISA、微粒酶免疫分析法(MEIA)、高效液相色譜法(HPLC)法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/MS)法和酶增強免疫分析法(EMIT)［8］。本試驗選擇ELISA法，其靈敏度高，特異性好，設(shè)備簡單，操作方便，結(jié)果易判斷。試劑盒附帶標準品和低、高兩個質(zhì)控品，測定時只需滿足低、高質(zhì)控樣品“在控”，即可保證結(jié)果的準確性。盡管質(zhì)控允許的誤差范圍比一般TDM質(zhì)控允許誤差范圍大，但由于其測定過程中試驗步驟多、周期長，測定人員不固定，測定結(jié)果易受溫度等外界因素干擾，所以，儀器的維護和校準是保證結(jié)果準確的前提。此外，試劑盒、質(zhì)控盒、標準曲線盒應(yīng)置于冰箱保存，無變質(zhì)、過期，從而保證為臨床提供準確的測定結(jié)果，以制定合理的個體化給藥方案。

4.2 FK506藥物濃度監(jiān)測隨行質(zhì)控分析 目前，常規(guī)FK506血藥濃度監(jiān)測質(zhì)量控制采用定期或每次測定樣本時隨行測定質(zhì)控樣本，只要質(zhì)控樣本的測定結(jié)果落在說明書允許的誤差范圍內(nèi)，則判斷此測定結(jié)果可靠［9］。這種判斷標準忽略了評價的連續(xù)性，不能及時發(fā)現(xiàn)影響測定準確性的潛在因素。此外，也有采用SPSS統(tǒng)計軟件質(zhì)控程序，其主要用于處理每日多點質(zhì)控數(shù)據(jù)，對本實驗數(shù)據(jù)的處理有一定局限性。本試驗采用室內(nèi)單值質(zhì)控法，即Levey-Jennings質(zhì)控法，通過回顧性計算均值及標準差，以X±2S為警告限，以X±3S為失控限，繪制指控圖。每次僅需監(jiān)測一次質(zhì)控樣品，用室內(nèi)質(zhì)控圖對監(jiān)測結(jié)果可靠性進行判斷，即室內(nèi)質(zhì)控“失控”時未查明原因前監(jiān)測結(jié)果不宜發(fā)出，室內(nèi)質(zhì)控“在控”時，方可發(fā)出監(jiān)測結(jié)果［10］。在實際監(jiān)測中及時繪制質(zhì)控圖，根據(jù)質(zhì)控圖對監(jiān)測結(jié)果加以判斷。若質(zhì)控測定存在漂移、趨勢性變化，則立即分析出現(xiàn)這種定向趨勢的原因，排查誤差并分析可能存在的影響因素并及時糾正，以確保提供準確可靠的血藥濃度測定結(jié)果。本文回顧分析了近2年的質(zhì)控監(jiān)測結(jié)果，通過繪制質(zhì)控圖，發(fā)現(xiàn)低、高質(zhì)控結(jié)果均在警告限范圍內(nèi)，且在中心線兩側(cè)規(guī)律波動，未出現(xiàn)定向改變的趨勢，表明每次的TDM監(jiān)測結(jié)果準確可靠，具有臨床指導意義。

5 小結(jié)

本文對2007年6月-2010年7月FK506血藥濃度監(jiān)測過程中的隨行質(zhì)控數(shù)據(jù)進行了回顧性分析，對其進行單向方差分析，繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖。結(jié)果表明，2007年6月-2010年7月隨行的質(zhì)控分析結(jié)果均“在控”，質(zhì)控結(jié)果均在誤差允許范圍內(nèi)，說明FK506血藥濃度監(jiān)測結(jié)果數(shù)據(jù)可靠，準確度高，具有較好的臨床指導意義。

［1］李紅梅，施向東.他克莫司治療激素抵抗性腎病綜合征［J］.實用醫(yī)學雜志，2009，25(22):3871-3873.

［2］張慶，劉世霆，許軍.免疫抑制劑對合并或不合并移植術(shù)后的糖尿病腎移植患者自測健康的影響［J］.中國藥房，2010，21(10):941-944.

［3］王晨丹，李榮山.他克莫司與西羅莫司根據(jù)細胞周期序貫用藥對阿霉素腎病大鼠的影響［J］.中國醫(yī)藥，2011，6(5):561-564.

［4］劉宏，童俊容.他克莫司致嚴重貧血1例［J］.實用醫(yī)學雜志，2011，27(16):3018-3018.

［5］張弋，高仲陽，鄭嫦云.他克莫司異常血藥濃度成因初探［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2005，25(8):746-747.

［6］逢曉云.他克莫司的藥理作用及臨床應(yīng)用［J］.中國藥師，2006，9(5):462-463.

［7］張寧，呂慧怡，范廣俊，等.酶聯(lián)免疫法監(jiān)測肝移植術(shù)后他克莫司血藥濃度［J］.大連醫(yī)科大學學報，2006，28(5):419-420.

［8］楊志福，趙磊，高迎春，等.酶聯(lián)免疫法與微粒子酶免疫法檢測全血他克莫司濃度的比較［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2002，22(6):346-348.

［9］儲小曼.環(huán)孢素和苯妥因治療藥物監(jiān)測內(nèi)部質(zhì)控聯(lián)系性的評價［J］.中國藥房，2006，17(6):440-442.

［10］秦曉光.室內(nèi)質(zhì)控的主要工具-質(zhì)量控制圖［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2003，26(11):710-712.