依達(dá)拉奉對大鼠XRCC1和細(xì)胞凋亡的影響

王 智，薛榮亮，趙紅霞，高 慧，魏 欣

臨床上遇到心跳驟停等危急狀況，經(jīng)過積極搶救后，盡管呼吸心跳恢復(fù)，但常遺留不同程度的腦機能障礙，這主要與腦缺血再灌注損傷以及遲發(fā)性神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可由多種因素啟動，DNA損傷與修復(fù)直接關(guān)系到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，DNA修復(fù)蛋白表達(dá)的逐漸衰減導(dǎo)致細(xì)胞凋亡逐漸增多［2］。如能發(fā)現(xiàn)對DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡起保護作用的因素，有可能為臨床治療缺血性腦損傷疾病提供一條新的途徑。

近年研究表明，依達(dá)拉奉通過清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞壞死，從而改善腦缺血及再灌注后的細(xì)胞功能，達(dá)到腦保護的作用［3］。同時，許多相關(guān)研究表明，依達(dá)拉奉可以減少自由基對DNA損傷［4-6］。但是其發(fā)揮腦保護作用的具體機制尚不清楚，目前鮮有資料報道依達(dá)拉奉對全腦缺血/再灌注中DNA損傷與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。本實驗建立了全腦缺血/再灌注大鼠模型，擬研究腦缺血敏感區(qū)海馬CA1區(qū)DNA修復(fù)蛋白XRCC1表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及依達(dá)拉奉對其的影響，探索依達(dá)拉奉腦保護機制，以期為臨床治療腦缺血/再灌注損傷、改善預(yù)后提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠108只，鼠齡55～65 d，體質(zhì)量290～310 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。術(shù)前夜禁食，隨意進(jìn)水。依達(dá)拉奉(購自吉林省博大制藥有限責(zé)任公司)，原位末端標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(購自美國Promega公司)，SABC(兔IgG)-POD試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒、XRCC1兔抗多克隆抗體(均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 108只大鼠隨機分成3組:假手術(shù)組(SH組)、缺血/再灌注組(IR組)、依達(dá)拉奉干預(yù)組(ED組)。每組根據(jù)再灌注后處死時間的不同再分為2、6、12、24、48 和 72 h 6 個亞組，每亞組6只大鼠。

1.2.2 模型制備 采用四血管阻塞法［7］建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。IR組和ED組動物予以微動脈夾夾閉頸總動脈5min后，松開動脈夾以恢復(fù)腦血流。SH組大鼠僅游離暴露雙側(cè)頸總動脈及椎動脈，不予以凝斷椎動脈和夾閉雙側(cè)頸總動脈處理。SH組和IR組全腦缺血再灌注后，即時分別腹腔注射生理鹽水4mL/kg，ED組腹腔注射依達(dá)拉奉溶液10 mg/kg。三組大鼠分別于再灌注后2、6、12、24、48、72 h 給予處死。以4%多聚甲醛200mL心臟灌注處死，取出完整大腦，在視交叉后1mm和4mm處各切一刀，取中間小塊腦組織(海馬頭端)，將組織塊在4%多聚甲醛液中浸泡，4℃保存3 d后制備切片。

1.2.3 原位細(xì)胞凋亡檢測法(TUNEL) 取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。蛋白酶K(20 mg/L)室溫消化，用甲醇配制的30mL/L過氧化氫消除內(nèi)源性辣根過氧化酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)與生物素標(biāo)記的核苷混合物(biotin-11-dUTP)混合反應(yīng)進(jìn)行孵育，再加鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化物酶溶液(Streptavidin-HRP溶液)進(jìn)行孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細(xì)胞，最后復(fù)染、脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察每張切片海馬CA1區(qū)，隨機選取5個視野，分別計算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。定量分析方法:光鏡下計算凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)。凋亡指數(shù)計算方法:分別計算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測 取海馬冠狀石蠟切片，采用SABC法行免疫組化法。切片依次脫蠟至水，30mL/L過氧化氫孵育10min，三蒸水沖洗5min。PBS(pH 7.4)浸泡5min，電爐水浴抗原修復(fù)，加熱至95℃ 15～20min后，自然冷卻至室溫。滴加正常山羊封閉血清，室溫孵育1 h，浸入勿洗。滴加1∶100的XRCC1多抗，放入4℃冰箱過夜。PBS沖洗5min，3次，擦干切片周圍水分后，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃溫箱孵育1 h;PBS沖洗5min，3次，擦干切片周圍水分后，滴加SABC復(fù)合物，放入37℃溫箱孵育20min。三蒸水洗5min，3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。切片中顯示細(xì)胞胞漿黃染、有棕黃色顆粒者為XRCC1陽性細(xì)胞。定量分析方法:光鏡下計算陽性細(xì)胞指數(shù)。方法:在400倍光鏡下觀察切片海馬CA1區(qū)，隨機選取5個視野，分別計算陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞率 =陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL法 SH組凋亡率較低;IR組凋亡率于缺血再灌注后6 h開始明顯增多，48 h凋亡率最高，與SH組比較，IR組凋亡率顯著增高(P＜0.01);ED組在6 h后各時點凋亡率較IR組明顯降低(P＜0.01)。見表1、圖1～圖3。

表1 大鼠全腦缺血再灌注后各時點海馬CA1區(qū)凋亡指數(shù)比較

圖1 光鏡下缺血再灌注48 h SH組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

圖2 光鏡下缺血再灌注48 h IR組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

圖3 光鏡下缺血再灌注48 h ED組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.2 XRCC1蛋白免疫組化顯示，SH組XRCC1蛋白在各時點表達(dá)較明顯;IR組XRCC1表達(dá)在缺血再灌注后2 h開始明顯下降，與SH組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。ED組XRCC1表達(dá)降低沒有IR組明顯，在各時點與IR組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2、圖4～圖6。

表2 大鼠全腦缺血再灌注后各時點海馬CA1區(qū)XRCC1陽性細(xì)胞率的比較

圖4 光鏡下缺血再灌注48 h SH組海馬CA1區(qū)XRCC1表達(dá)(免疫組化，×400)

圖5 光鏡下缺血再灌注48 h IR組海馬CA1區(qū)XRCC1表達(dá)(免疫組化，×400)

圖6 光鏡下缺血再灌注48 h ED組海馬CA1區(qū)XRCC1表達(dá)(免疫組化，×400)

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個極為復(fù)雜的病理生理過程，其中包括眾多環(huán)節(jié)，如能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用、氧自由基生成、線粒體功能障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等［9-10］。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此關(guān)聯(lián)，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終造成比缺血更加嚴(yán)重的組織功能損傷。

在對腦缺血再灌注損傷機制的研究中，發(fā)現(xiàn)許多因素都可以引起DNA損傷，同時亦會損傷DNA的修復(fù)功能［11］，DNA損傷與修復(fù)直接關(guān)系到細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。腦缺血再灌注損傷中，DNA的損傷和修復(fù)功能降低可最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［2］。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注后的細(xì)胞凋亡是一個具有時間依賴性的動態(tài)演變過程，尚未凋亡的細(xì)胞，隨著再灌注時間的延長和DNA損傷的逐漸累積而最終導(dǎo)致凋亡［12］。

X線修復(fù)交叉互補組1(X-ray repair cross complementing 1，XRCC1)基因是參與哺乳動物DNA修復(fù)的重要修復(fù)基因之一，其編碼翻譯的XRCC1蛋白作為堿基切除修復(fù)中介，可調(diào)節(jié)酶的活性。XRCC1蛋白上調(diào)DNA連接酶3、脫嘌呤嘧啶核酸內(nèi)切酶、多核苷酸激酶，抑制PARP-1/2和DNA聚合酶 β 的活性［13］。因此，XRCC1蛋白通過影響所有參與DNA堿基切除修復(fù)的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞對DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮極其重要的作用。缺乏XRCC1蛋白的細(xì)胞死亡率增加10倍，DNA單鏈損傷的修復(fù)率為不缺乏XRCC1蛋白細(xì)胞的1/5［14］。有研究應(yīng)用成年CD-1雄鼠局灶腦缺血再灌注模型、免疫組化和 TUNEL雙標(biāo)，表明失去XRCC1免疫活性神經(jīng)元同時表達(dá)TUNEL陽性，表明XRCC1早期降低先于DNA斷裂的發(fā)生，并導(dǎo)致隨后的細(xì)胞凋亡［15］。在缺血腦損傷中，導(dǎo)致XRCC1蛋白下降的具體機制還不清楚，如果能早期發(fā)現(xiàn)這些DNA修復(fù)功能受損但尚未凋亡的細(xì)胞，并積極采取措施使之逆轉(zhuǎn)，則有可能為臨床治療缺血性腦損傷疾病提供一條新的途徑。

依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑和抗氧化劑，其分子結(jié)構(gòu)上具有親脂基團，血腦屏障的通透性高［16-17］。其作為自由基捕獲劑，能抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性，刺激前列環(huán)素的生成，減少炎癥介質(zhì)白細(xì)胞三烯生成，降低羥自由基濃度，縮小缺血半暗帶發(fā)展成梗死的體積［18-19］。Yamamoto 等［20］建立腦缺血模型，于再灌注后靜注依達(dá)拉奉，并在海馬內(nèi)植入微透析探針，發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可抑制再灌注后羥自由基產(chǎn)物-2，3二羥基苯甲酸(2，3-DHBA)濃度的增加，減少海馬錐體細(xì)胞凋亡，說明依達(dá)拉奉可抑制缺血后海馬區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡。但依達(dá)拉奉抑制細(xì)胞凋亡的具體機制，特別是在全腦缺血再灌注后對DNA損傷修復(fù)有哪些影響，鮮有資料報道。

本試驗通過建立全腦缺血模型，給予依達(dá)拉奉腹腔注射后，發(fā)現(xiàn)腦缺血/再灌注6 h時，海馬CA1區(qū)凋亡率顯著增高，一直持續(xù)到72 h。這可能與依達(dá)拉奉的藥物代謝動力學(xué)與有關(guān)，與依達(dá)拉奉的血藥濃度曲線一致［21］。

給予依達(dá)拉奉腹腔注射后，腦缺血/再灌注后2 h，缺血區(qū)XRCC1蛋白的表達(dá)比IR組增多，持續(xù)至再灌注后72 h。由此推論，在大鼠全腦缺血再灌注損傷過程中，依達(dá)拉奉通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)蛋白XRCC1在腦組織的表達(dá)，干擾單鏈損傷，減少細(xì)胞凋亡，對腦缺血/再灌注損傷具有治療意義。

本研究結(jié)果一方面再次論證DNA修復(fù)蛋白XRCC1在阻止腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡上起作用這一推論，另一方面提示，依達(dá)拉奉通過增強腦缺血/再灌注早期DNA修復(fù)蛋白XRCC1的表達(dá)而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，這或許是依達(dá)拉奉治療缺血性腦血管病的分子機制之一，但依達(dá)拉奉對腦缺血/再灌注后腦細(xì)胞中XRCC1的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的確切機制尚待進(jìn)一步研究。

總之，大鼠全腦缺血再灌注時應(yīng)用依達(dá)拉奉，可減緩DNA修復(fù)蛋白XRCC1表達(dá)的下降，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)，從而阻止錐體細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到腦保護作用。

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