皂莢抗肝癌細(xì)胞成分的初步研究

張振宇 張曉麗 程紅球

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041；2廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035）

皂莢為豆科植物皂莢的果實，味咸，性溫，無毒，是中醫(yī)治療乳腺癌、肺癌、肝癌等多種癌癥常用的配伍藥之一，被列為抗癌中草藥。2005年6月，香港理工大學(xué)與美國國立癌癥研究所研究發(fā)現(xiàn)［1-2］，皂莢的濃縮液具有抗癌特性，可有效地抑制血癌及多種人類固體腫瘤，包括乳腺癌、肝癌和前列腺癌等癌細(xì)胞的生長，但其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不明。本實驗主要通過逐級提純皂莢研究其對肝癌細(xì)胞的作用機制，并為進一步分析其作用成分提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞bel-7402，由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所陳瑞銘1978年建株，購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 藥物皂莢由湖北省藥材公司提供，皂莢提取液由湖北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制作提供，皂莢生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL。

1.3 試劑及儀器bax單抗、bcl-2單抗、P53單抗、超敏S-P（鼠）即用型免疫試劑盒、DAB顯色劑、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、TIANamp Genmic血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、PCR-ELISA端粒酶試劑盒均由福建邁新公司提供，RPMI-1640培養(yǎng)液、DMSO、小牛血清、MTT等均由晶美公司提供。流式細(xì)胞儀（美國COUITER公司，EPICSELTE ESP型），倒置相差顯微鏡 （日本OLYMPUS公司，LH50A型），電泳儀（CBS公司，MGU-102T），凝膠成像分析儀 （美國UVP公司，GDS8000型），液閃儀（美國BACKMAN COULTER公司，LS6500型），酶標(biāo)儀器（美國Bio-Rad公司），凈化工作臺（蘇州，SW-CJIF 型），CO2培養(yǎng)箱（美國 SHELDON 公司，TC2323型）。

1.4 分組隨機分為對照組、皂莢提取物低、中、高劑量組（質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.1、0.2 mg/mL）。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞bel-7402接種于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，在37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.6 MTT法檢測藥物對細(xì)胞生長的抑制情況將傳代的人肝癌細(xì)胞bel-7402濃度調(diào)整為5×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，共分4組，每組均設(shè)為6個平行孔，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞生長旺盛后，去培養(yǎng)液，隨機分為對照組，皂莢提取物低、中、高劑量組 （質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg/mL）。 對照組不加藥物，皂莢提取物各劑量組分別加藥液180 μL并繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，各孔再加入 MTT 貯液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，將培養(yǎng)板置于微孔振蕩器上振蕩10 min，溶解微小結(jié)晶，然后全自動酶標(biāo)儀上選擇波長490 nm檢測各孔A值。計算細(xì)胞增殖抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡峰將bel-7402細(xì)胞分別培養(yǎng)在對照組（無藥血清培養(yǎng)液）、皂莢提取物低、中、高劑量組（質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.1、0.2 mg/mL）培養(yǎng)液中，培養(yǎng) 72 h后收集各組細(xì)胞并制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次后再將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL，以 70%的冷乙醇 （1∶4）固定待檢，用 PBS洗去固定液，加RNaseA，37℃水浴30 min，再加PI染色液混勻，4℃避光30 min，在流式細(xì)胞儀上選擇488 nm激發(fā)光檢測各組細(xì)胞DNA含量，得出凋亡率。

1.8 檢測凋亡相關(guān)基因表達免疫組化法檢測bax、bcl-2、P53蛋白的表達。取對數(shù)生長期細(xì)胞bel-7402，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL接種于內(nèi)置無菌玻片24孔培養(yǎng)板（1mL/孔）。培養(yǎng)24 h后，分為對照組（不加藥物），皂莢提取物低、中、高劑量組（質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg/mL）。以上各組平行3孔，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后爬片用PBS漂洗兩遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后自然風(fēng)干，-20℃保存?zhèn)溆?。檢測方法按免疫組化試劑盒說明書進行。陽性細(xì)胞的特征為胞漿或胞核染為黃色或棕黃色，陰性細(xì)胞不染色。

1.9 端粒酶活性測定按端粒酶檢測試劑盒說明書進行。即：將bel-7402細(xì)胞分別培養(yǎng)在對照組（無藥血清培養(yǎng)液），皂莢提取物低、中、高劑量組（質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.1、0.2 mg/mL），培養(yǎng)72 h后收集各組細(xì)胞于1.5 mL Ep管，加入1×CHARPS裂解液200 μL，震蕩懸浮細(xì)胞。冰浴包被30 min后，12000 r/min，4℃，離心20 min，吸取上清，即得到含有端粒酶的細(xì)胞提取物。在PCR管中加入 PCR 反應(yīng)液（5×TARP反應(yīng)液 10 μL、Taq酶 2U、雙蒸水 37.6 μL、細(xì)胞提取物 2 μL），30 ℃，延伸擴增反應(yīng) 30 min，然后進行PCR反應(yīng)33個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃，30 s，55℃，30 s。將酶標(biāo)板包被阻斷稀釋緩沖液兩次后，加入TARP反應(yīng)液5 μL，37 ℃孵育 60 min，洗滌，加入 anti-DAPAb 100 μL/孔室溫包被30 min，洗滌，加入TMB反應(yīng)液，室溫包被3～10 min后，加入終止液100 μL/孔，在酶標(biāo)儀上選擇波長450 nm測定吸光度A值。計算抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 皂莢提取物對bel-7402細(xì)胞增殖的影響見表1。MTT法實驗結(jié)果顯示，皂莢提取物中、高劑量組對人肝癌細(xì)胞bel-7402增殖均具有顯著的抑制作用 （P＜0.05），其中高劑量組對bel-7402細(xì)胞增殖的抑制作用具有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。

表1 各組bel-7402細(xì)胞增殖比較（±s）

表1 各組bel-7402細(xì)胞增殖比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n A值 抑制率（%）對照組 6 1.721±0.031皂莢提取物低劑量組 6 1.556±0.023 9.31皂莢提取物中劑量組 6 1.502±0.017* 12.79皂莢提取物高劑量組 6 1.431±0.018** 16.86

2.2 皂莢提取物對bel-7402細(xì)胞周期的影響見表2。皂莢提取物低、中、高劑量組與對照組作用人肝癌bel-7402細(xì)胞72 h后，bel-7402細(xì)胞在G0～G1期的比例增高，S期的比例降低，與對照組比較差異非常顯著（P＜0.01），在G0～G1期前可見凋亡峰。

表2 各組bel-7402細(xì)胞周期比較（%，±s）

表2 各組bel-7402細(xì)胞周期比較（%，±s）

組 別 n G0-G1對照組 3 27.30±1.11皂莢提取物低劑量組 3 36.96±1.98**皂莢提取物中劑量組 3 45.43±1.34**皂莢提取物高劑量組 3 49.75±2.97**S G2-M 70.93±2.41 1.77±0.21 62.57±1.02 0.47±0.08 50.27±1.31 2.30±0.41 41.95±1.43 3.63±0.73

2.3 皂莢提取物對bel-7402細(xì)胞凋亡基因的影響見表3。皂莢提取物低、中、高劑量組bcl-2表達顯色與對照組比較無顯著差異，bax、P53表達顯色較對照組明顯加深，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或 0.01），且皂莢提取物低、中、高劑量組組間 bax、P53蛋白表達無顯著差異。

表 3 各組 P53、bax、bcl-2 表達比較（%，±s）

表 3 各組 P53、bax、bcl-2 表達比較（%，±s）

組 別 n P53陽性細(xì)胞率對照組 3 24.50±6.04皂莢提取物低劑量組 3 26.13±0.47*皂莢提取物中劑量組 3 34.97±2.34**皂莢提取物高劑量組 3 38.50±0.53**bax陽性細(xì)胞率 bcl-2陽性細(xì)胞率21.03±2.57 41.27±2.14 27.80±1.21** 39.18±1.52 34.61±0.54** 37.23±1.16 40.33±0.52** 36.73±2.79

2.4 皂莢提取物對bel-7402細(xì)胞端粒酶活性的影響見表4。與對照組比較，皂莢提取物低、中、高劑量組顯著下降（P＜0.05或0.01），表明皂莢提取物各劑量血清均可抑制bel-7402細(xì)胞端粒酶活性，其中皂莢提取物高劑量組對bel-7402細(xì)胞端粒酶活性的抑制具有非常顯著的作用（P＜0.01），

表4 各組bel-7402端粒酶的活性比較（±s）

表4 各組bel-7402端粒酶的活性比較（±s）

組 別 n 端粒酶活性（A450） 抑制率（%）對照組 6 0.935±0.049皂莢提取物低劑量組 6 0.672±0.076* 28.7皂莢提取物中劑量組 6 0.632±0.035* 32.9皂莢提取物高劑量組 6 0.562±0.056** 40.4

3 討 論

肝癌的發(fā)生機制大致認(rèn)為是致癌因素導(dǎo)致染色體畸變 （錯位、倒轉(zhuǎn)、斷裂、插入、重排等）、癌基因的激活、生長因子及其受體的異常、抑癌基因的失活等，導(dǎo)致肝細(xì)胞的遺傳學(xué)特征發(fā)生改變，最終形成肝癌細(xì)胞。肝細(xì)胞癌變包括基因突變與基因調(diào)控失常兩種理論解釋。人肝癌細(xì)胞的生長受凋亡抑制基因與凋亡促進基因的調(diào)控。bax、bcl-2均可彼此形成異二聚體或與自身形成同源二聚體，其抑制或促進凋亡主要取決兩者的比例。當(dāng)bax蛋白或蛋白二聚體占優(yōu)勢時，細(xì)胞凋亡可被誘導(dǎo)；當(dāng)bcl-2蛋白或蛋白二聚體占優(yōu)勢時，細(xì)胞凋亡被抑制。P53則嚴(yán)密監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)外的變化，一旦細(xì)胞受到攻擊出現(xiàn)損傷，P53立即被激活，使受損傷的細(xì)胞停頓在G1期以便DNA得到修復(fù)，或指示其進入凋亡［2］。P53基因發(fā)生突變或者其功能失活后，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失去一種具有抑制作用的調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞程序性死亡的調(diào)節(jié)失去一種具有促進作用的調(diào)節(jié)因子，最終使細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂和癌變［3］。當(dāng)細(xì)胞周期發(fā)生障礙時，細(xì)胞增殖將受到抑制，而DNA合成障礙是細(xì)胞周期發(fā)生障礙的較常見原因［4-5］。 另外，研究表明［6-7］，腫瘤細(xì)胞大多表達端粒酶活性增強，而細(xì)胞增殖周期的調(diào)控與端粒酶活化密切相關(guān)，端粒酶活化有可能是所有惡性腫瘤發(fā)生過程的一個必經(jīng)之路，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活最終導(dǎo)致端粒酶活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞端粒的丟失與重新組合達到一種動態(tài)平衡，惡性腫瘤細(xì)胞得以無限繁殖［8］。

本實驗顯示，皂莢提取物對人肝癌細(xì)胞bel-7402的增殖具有顯著抑制作用，能夠誘導(dǎo)bel-7402細(xì)胞凋亡，抑制bel-7402細(xì)胞端粒酶活性，調(diào)控癌基因活化與抑癌基因失活，阻止腫瘤細(xì)胞的無限繁殖。與對照組比較，高劑量皂莢提取物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用更顯著。本次研究的各個項目的數(shù)據(jù)結(jié)果并不完全一致，考慮可能與藥物質(zhì)量濃度的穩(wěn)定性及純度有一定關(guān)系。筆者推測皂莢提取物對腫瘤細(xì)胞的作用機制可能如下：抑制活化的端粒酶，阻止細(xì)胞DNA的無限繁殖；提升抑癌基因的活性，促進癌細(xì)胞的凋亡；可能作為一種信息物質(zhì)，直接參與細(xì)胞凋亡活動，抑制腫瘤細(xì)胞DNA無限復(fù)制。

［1］Yashima K，Litey LA，Kaiser L，et al.Telomerase activity in gastriccancer［J］.Cancer Res，1997，57（12）：2373-2377.

［2］楊建青，楊連粵.化療誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡中p53和bcl-2基因的調(diào)控［J］.中華肝膽外科雜志，2001，7（1）：31-33.

［3］成軍.腫瘤相關(guān)基因［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，1999：102.

［4］Enoch T，Norbury C.Cellular resoneses to DNA damage：Cell-cycle checkpoints，apotosisand the roles of p53 and Atm［J］.Trends Biochem Sci，1995，20：426-430.

［5］Terada T，Nakanuma Y.Expression of apoptosis，proliferating cellnuclear antigens （bcl-2，C-myc，F(xiàn)as，Lewis and p53）in human cholangiocarcinomas and hepatocellarcarcinomas［J］.Pathol Int，1996，46：764-770.

［6］Kim NW，Piatysezk MA，Prouse KR，et al.Specific associasion of humantelomerse activity with immortal cellsand cancer［J］.Sciene，1994，266（18）：2011-2015.

［7］Landberg G，Niesen NH，Nilsson P，et al.Telomerase activity is asscission with cell cycle deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res，1997，57（3）：549-553.

［8］Rhyu MS.Telomerase，and immortality［J］.Jnatl Cancer Inst，1995，87：884-885.