美珍顆粒劑對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜保護(hù)作用及機(jī)制研究*

龍 惠 嚴(yán) 莉 黃國棟 黃媛華 蔣 芳 柯詩文 余淑嬌

（1.廣東省廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095；2.南昌有色冶金設(shè)計(jì)研究院，江西 南昌330006；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬衡陽醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確的結(jié)腸炎性病變［1-3］。近年來UC常采用激素和柳氮磺胺吡啶（SASP）及中藥口服結(jié)合灌腸治療，但副作用大。本研究采用美珍顆粒劑進(jìn)行抗UC的實(shí)驗(yàn)研究，以期獲取雙歧桿菌等腸道細(xì)菌計(jì)數(shù)等反映抗UC療效的關(guān)鍵指標(biāo)，同時(shí)檢測腸黏膜組織核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）及血清白細(xì)胞介素（IL）-1β 和 IL-6 的表達(dá)，并與SASP對照，旨在進(jìn)一步探討美珍顆粒劑在UC發(fā)病中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠80只，雄性，體質(zhì)量200 g左右，11～13周齡，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)部提供。

1.2 藥物與試劑 2，4二硝基氯苯（DNCB）和美珍顆粒劑（由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供）；NF-κB及IL-6單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），IL-1β試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。超氧化物歧化酶 （SOD），過氧化脂質(zhì)（LPO）免疫組化檢測及其相關(guān)試劑由晶美有限公司提供。

1.3 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為美珍顆粒劑組、SASP組、模型組、正常組，每組均為20只，除正常組外其余3組動物進(jìn)行造模。大鼠頸背部剃毛后，每日以2%DNCB丙酮液滴背1次，每次5滴，連用7 d致敏。其后每日向大鼠肛內(nèi)深度6 cm處的結(jié)腸腸腔輕緩灌注0.45%DNCB乙醇液1次，每次0.25 mL，連續(xù)5 d，得到 UC 大鼠模型［4］。

1.4 給藥方法 造模結(jié)束后，美珍顆粒劑組按100 mg/kg體質(zhì)量灌胃美珍顆粒劑，每日1次；SASP組按100 mg/kg體質(zhì)量灌胃SASP，每日1次。正常組不作任何處理，正常喂養(yǎng)。模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液100 mg/kg，每日1次。所有動物均治療4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 第5周腹主動脈無菌取血4 mL左右，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清IL-1β和IL-6的表達(dá)，隨后斷頭處死，剪取病變最明顯處結(jié)腸組織，冰凍保存常規(guī)病理切片并攝像，計(jì)算結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)，免疫組化檢測腸黏膜NF-κB的表達(dá)。結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)，以結(jié)腸黏膜損傷點(diǎn)的長度計(jì)算，即≤0.5 mm為1分，≤1 mm為2分，≤2 mm為3分，以次類推，損傷點(diǎn)寬度≥2 mm時(shí)，分?jǐn)?shù)加倍。SOD：按文獻(xiàn)［5］的腎上腺素法略加改進(jìn)進(jìn)行測定。結(jié)腸黏膜LPO［6］測定，在刮取胃黏膜中按1∶10加入1 mL 4℃的0.3 mol/L蔗糖液，勻漿，以4000 r/min離心10 min，取上清液測酶活性，其中取一部分結(jié)腸黏膜迅速浸入4%多聚甲醛0.1 M/PBS（含 1/1000 DEPC）中固定，制備4 μm厚石蠟連續(xù)切片，免疫組化檢測腸黏膜NF-κB的表達(dá)。免疫組化按即用型一步快速免疫組化Max Vision TM試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較經(jīng)方差齊性分析后采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Bivariate Two-tailed檢驗(yàn)，求Pearson系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理切片 HE染色后鏡下觀察各組大鼠的組織學(xué)損傷情況：正常組大鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)遭嚴(yán)重破壞，部分區(qū)域黏膜壞死、脫落，有些病變深達(dá)黏膜下層、肌層或漿膜層；黏膜內(nèi)腺體排列紊亂或缺如，細(xì)胞高度水腫，充血明顯，并呈局灶性出血，細(xì)胞間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤。SASP組、美珍顆粒劑組大鼠結(jié)腸黏膜均見愈合，但美珍顆粒劑組愈合最好。

2.2 結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)和大便乳酸含量比較 見表1。從潰瘍的發(fā)病程度上來看，模型組、美珍顆粒劑組及SASP組均可見潰瘍形成，以模型組的損傷分?jǐn)?shù)和大便乳酸含量最高，而美珍顆粒劑組及SASP組的損傷分?jǐn)?shù)和大便乳酸含量均較模型組明顯降低（P＜0.05），而美珍顆粒劑組尤為顯著（P＜0.01）。

表1 各組結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)和大便乳酸含量比較（±s）

表1 各組結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)和大便乳酸含量比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 SASP 組比較，△P＜0.01。 下同。

組 別 n 結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù) 大便乳酸含量（mg/10 g）正常組 20 0 6.25±0.21模型組 20 18.12±1.01 6.14±0.21 SASP 組 20 11.41±1.01* 3.62±0.21*美珍顆粒劑組 20 4.71±1.01*△ 1.71±0.21*△

2.3 各組紅細(xì)胞SOD及結(jié)腸黏膜LPO含量比較 見表2。與正常組SOD含量相比，模型組、美珍顆粒劑組及SASP組SOD含量均下降，組間比較有顯著差異（P＜0.05），而美珍顆粒劑組及SASP組的SOD含量均較模型組明顯升高，而美珍顆粒劑組尤為顯著（P＜0.01），而與正常組的LPO含量相比，模型組、美珍顆粒劑組及SASP組LPO含量均升高，組間比較有顯著差異（P＜0.05），而美珍顆粒劑組及SASP組的LPO含量均較模型組明顯下降，而美珍顆粒劑組尤為顯著，組間比較有顯著差異（P＜0.01）。

表2 各組紅細(xì)胞SOD及結(jié)腸黏膜LPO含量比較（±s）

表2 各組紅細(xì)胞SOD及結(jié)腸黏膜LPO含量比較（±s）

組 別 n SOD（U/mL） LPO（nmol/mg）正常組 20 37.35±1.22 1.51±0.21模型組 20 6.21±1.21 15.41±0.22 SASP 組 20 9.01±1.21* 9.11±0.22*美珍顆粒劑組 20 17.11±1.12**△ 6.11±0.22**△

2.4 UC大鼠治療后腸黏膜周邊組織血清IL-1β和IL-6的表達(dá)比較 見表3。與模型組IL-6和IL-1β相比，美珍顆粒劑組及SASP組IL-6和IL-1β均下降，組間比較有顯著差異 （P＜0.05），美珍顆粒劑組治療后IL-6和IL-1β因子表達(dá)進(jìn)一步減弱，與SASP組相比有明顯差異（P＜0.01）。

表3 各組治療后IL-6和IL-1β表達(dá)比較（%，±s）

表3 各組治療后IL-6和IL-1β表達(dá)比較（%，±s）

組 別 n IL-6 IL-1β正常組 20 13.42±0.62 13.31±0.53模型組 20 126.21±2.12 216.12±0.22 SASP 組 20 67.33±2.11* 118.31±0.21*美珍顆粒劑組 20 19.22±2.02**△ 25.31±0.21**△

2.5 UC大鼠治療后腸黏膜周邊組織NF-κB的表達(dá)比較 見表4。與正常組的NF-κB相比，模型組、美珍顆粒劑組及SASP組NF-κB均上升，組間比較有顯著差異（P＜0.05），美珍顆粒劑組治療后NF-κB因子表達(dá)進(jìn)一步減弱，與SASP組相比有明顯差異（P＜0.01）。

表4 各組治療后NF-κB表達(dá)比較（%，±s）

表4 各組治療后NF-κB表達(dá)比較（%，±s）

組 別 n NF-κB正常組 20 4.21±0.32模型組 20 28.33±2.01*SASP 組 20 18.11±2.01*美珍顆粒劑組 20 8.61±2.01**△

3 討 論

近年來，用中醫(yī)辨證論治中藥口服結(jié)合灌腸治療的報(bào)道很多，但因?yàn)榉?、操作不便，臨床應(yīng)用受限。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC總屬泄瀉范疇，以大腸濕熱下注、氣滯血瘀或陰（血）虛腸燥為主要病機(jī)特點(diǎn)，以腹瀉、黏液膿血便、腹痛為主癥。本研究針對其病機(jī)和主證，將南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃國棟博士的驗(yàn)方——美珍顆粒劑應(yīng)用于UC，取得了快速的止血、鎮(zhèn)痛、消炎、收斂的作用，具有很好的抗UC效果。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，造模大鼠經(jīng)治療，結(jié)腸黏膜光鏡下組織學(xué)有明顯改變，結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)、大便乳酸含量降低，SOD升高，LPO降低，與模型組比較，有顯著差異（P＜0.05）。美珍顆粒劑組治療后NF-κB，IL-6，IL-1β因子表達(dá)進(jìn)一步減弱，與SASP組相比有明顯差異（P＜0.01）。因此筆者認(rèn)為美珍顆粒劑發(fā)揮抗UC的機(jī)制之一可能與其減弱NF-κB，IL-6，IL-1β的表達(dá)，降低結(jié)腸黏膜LPO含量，增加紅細(xì)胞SOD含量，進(jìn)而增加機(jī)體對O2-的清除，達(dá)到促進(jìn)大便乳酸排泄，減少結(jié)腸炎癥損傷有關(guān)。此項(xiàng)研究為美珍顆粒劑抗UC提供理論依據(jù)，為中藥新藥的篩選和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

［1］Cummings JH，Macfarlane GT，Macfarlane S.Intestinal bacteria and ulcerative colitis［J］.Curr Issues Intest Microbiol，2003，4（1）：9-20.

［2］Farrell RJ，La Mont JT.Microbial factors in inflammatory bowel disease［J］.Gas-troenterol Clin North Am，2002，31 （1）：41-62.

［3］Fiocchi C.Inflammatory bowel disease： etiology and pathogenesis［J］.Gastoenterology，1998，115：182-205.

［4］Sands BE.Therapy of inflammatory bowel disease［J］.Gastroenterology，2000，118：568-582.

［5］Hanahan F.Probiotics and inflammatory bowel disease：is there a scientific rationale?［J］.Inflammatory Bowel Dis，2000，6：107-115.

［6］于樹玉.腫瘤宿主全血清中脂質(zhì)過氧化水平動態(tài)變化及抗氧劑對其影響［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1984，6（5）：420.