人參皂苷Rb1減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷期間心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制*

劉川鄂 吳述軒 葉 剛

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

糖尿病患者圍術(shù)期并發(fā)癥和死亡率高于非糖尿病患者［1］，與其病理生理機(jī)制有關(guān)：糖尿病伴隨的逐漸加劇的氧化應(yīng)激損傷、糖尿病狀態(tài)下高血糖與蛋白質(zhì)形成的糖基化終末產(chǎn)物、增強(qiáng)多元醇路徑導(dǎo)致超氧陰離子（O2-）自由基的生成、PI3K活性降低等有關(guān)［2-3］。已有研究表明，人參皂苷Rb1做為參附注射液的主要有效成分，可以減輕糖尿病心肌缺血再灌注損傷［4］，但對心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制未明。本研究通過觀察人參皂苷Rb1預(yù)處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡及心肌磷酸化Akt（p-Akt）表達(dá)的影響，探討其減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2004-0007。

1.2 試藥與儀器 藥品：人參皂苷Rb1（中國藥品生物制品檢定所）；Wortmaninn（Sigma 公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒（Roche 公司）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma 公司）；兔抗鼠 Akt多克隆抗體（Cellsignaling Technology）。儀器：DW-2000型動物呼吸機(jī) （上海嘉鵬科技有限公司）；Olympus BX50顯微攝影系統(tǒng)（Olympus公司）；恒溫?fù)u床 （成都儀器廠）；-80℃深低溫冰箱（SANYO 公司）；V30掃描儀（Epson公司）

1.3 模型制備 大鼠禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）65 mg/kg，72 h后測定空腹血糖，連續(xù)8周空腹血糖＞16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，即為1型糖尿病模型制備成功。此后每2周測定1次空腹4 h血糖和體質(zhì)量，糖尿病大鼠自由飲水，普食飼養(yǎng)8周后制備心肌缺血/再灌注模型。大鼠腹腔注射巴比妥鈉（50 mg/kg）后實(shí)行氣管切開，機(jī)械通氣。置皮下電極監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖，右側(cè)股靜脈穿刺給藥。左胸第4肋間行開胸術(shù)后，切除心包膜暴露心臟，距左心耳下緣2 mm以6-0尼龍線結(jié)扎左冠動脈前降支（LAD）。LAD結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)為：左心室變白，心電圖提示ST段抬高。結(jié)扎30 min后，松開結(jié)扎線以恢復(fù)血流，再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)為：ST段回落，左心室復(fù)紅。

1.4 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為模型組、聯(lián)合組（人參皂苷Rb1+Wortmaninn）、人參皂苷Rb1組、Wortmaninn組，每組10只。模型組結(jié)扎LAD 30 min后恢復(fù)灌注120 min。Wortmaninn組于缺血前20 min，按15 μg/kg給予Wortmaninn；人參皂苷 Rb1組于缺血前10 min按40 mg/kg給予人參皂苷Rb1；聯(lián)合組分別于缺血前20、10 min，給予相同劑量的Wortmaninn和人參皂苷Rb1。Wortmannin和人參皂苷Rb1劑量參閱文獻(xiàn)［5-6］。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 心肌梗死面積測定：再灌注結(jié)束后，再次結(jié)扎LAD，經(jīng)股靜脈注入2 mL 1%濃度的依文思藍(lán)，依文思藍(lán)使非缺血區(qū)染色，用來評估缺血區(qū)面積，快速取出大鼠心臟冷凍后使用心臟切片槽將心臟垂直于心臟長軸切為2 mm厚心肌片，置于TTC溶液室溫育15 min，缺血區(qū)心肌呈磚紅色，梗死區(qū)心肌呈灰白色；心肌細(xì)胞凋亡的測定：制備心肌組織石蠟切片，采用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，每一切片選擇10個(gè)高倍鏡視野，TUNEL陽性的細(xì)胞細(xì)胞核被染成棕褐色；心肌Akt、p-Akt的測定：免疫印跡（westernblot）對p-Akt的測定。通過凝膠成像系統(tǒng)掃描，確定蛋白條帶密度的相對灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌梗死區(qū)百分比和心肌凋亡細(xì)胞百分比比較 見表1。與模型組比較，人參皂苷Rb1組心肌梗死區(qū)百分比和凋亡細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rb1組比較，聯(lián)合組心肌梗死區(qū)百分比和凋亡細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌梗死區(qū)百分比和心肌凋亡細(xì)胞百分比比較（%，±s）

表1 各組大鼠心肌梗死區(qū)百分比和心肌凋亡細(xì)胞百分比比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與人參皂苷Rb1組比較，△P＜0.05。

組 別 n 梗死區(qū) 凋亡細(xì)胞模型組 10 53.37±5.45 30.70±4.96人參皂苷 Rb1組 10 42.43±6.70* 26.15±3.06*聯(lián)合組 10 55.65±7.37△ 31.32±4.39△Wortmaninn 組 10 54.03±6.90 34.15±3.46

2.2 各組p-Akt表達(dá)比較 給予人參皂苷Rb1后，人參皂苷Rb1組 p-Akt表達(dá)（154.5±33.12）明顯高于模型組（90.3±13.02）（P＜0.05）；而在給予Wortmannin后聯(lián)合組大鼠心肌p-Akt（97.3±15.03）顯著低于人參皂苷 Rb1組（154.5±33.12）（P＜0.05）。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，它的發(fā)生受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。PI3K-Akt信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用［5］。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性。Akt是分子量約為57KU的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要節(jié)點(diǎn)。近年來研究表明，PI3K-Akt能經(jīng)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。PI3KAkt信號通路抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要有：（1）直接調(diào)節(jié)作用。哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是多級聯(lián)反應(yīng)的過程。BAD是Bcl-2家族成員之一，可與Bcl-2或Bcl-xl形成復(fù)合體而表現(xiàn)促凋亡活性。Akt是強(qiáng)有力的BAD激酶，活化的Akt可以使BAD的Ser136位點(diǎn)磷酸化，有效阻斷BAD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)用特異的PI3K抑制劑Wortmaninn處理后，Akt引起的BAD磷酸化受阻［6］；（2）通過直接或間接影響轉(zhuǎn)錄因子家族（Forkhead、NF-κB、p53等）發(fā)揮細(xì)胞存活調(diào)控作用。磷酸化的Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子能降低FasL的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡。Vandermoere等［7］研究證明Akt能夠直接或間接調(diào)節(jié)IKK的活性，導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)位、活化和NF-κB依賴的促進(jìn)存活基因的轉(zhuǎn)錄。Akt使NF-κB磷酸化后，激活它的轉(zhuǎn)錄功能，使促進(jìn)細(xì)胞存活的Bcl-2家族成員Bcl-xl表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。（3）防止線粒體釋放凋亡因子。線粒體可釋放細(xì)胞色素c及凋亡誘導(dǎo)因子，Akt可阻止其釋放從而起到抗細(xì)胞凋亡的作用［8］。

本研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下給予人參皂苷Rb1治療大鼠心肌p-Akt表達(dá)明顯增加，心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡明顯減少；而給予PI3K抑制劑Wortmannin后，p-Akt表達(dá)明顯減少，人參皂苷Rb1促進(jìn)p-Akt表達(dá)的作用明顯抑制，Rb1減少梗死面積和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用也被消除。這表明，人參皂苷Rb1可以在糖尿病大鼠心肌通過激活PI3K促進(jìn)p-Akt的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷。此外，人參皂苷Rb1具有清除氧自由基、阻斷細(xì)胞鈣超載藥理效應(yīng)，可能是其間接抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

［1］Trichon BH，Roe MT.Acute coronary syndromes and diabetes mellitus［J］.Diab Vasc Dis Res，2004，1（1）：23-32.

［2］Pacher P，Obrosova IG，Mabley JG，et al.Role of nitrosative stress and peroxynitrite in the pathogenesis of diabetic complications［J］.Curr Med Chem， 2005，12（3）：267-275.

［3］El-Remessy AB，Bartoli M，Platt DH.Oxidative stress inactivates VEGF survival signaling in retinal endothelial cells via PI3-kinase tyrosine nitration［J］.J Cell Sci， 2005，118（Pt 1）：243-252.

［4］張力，夏中元.人參皂苷Rb1預(yù)處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2010，12（3）：446-449.

［5］Huisamen B.Protein kinase B in the diabetic heart［J］.Mol Cell Biochem，2003，249（1-2）：31-38.

［6］Song G，Ouyang GL，Bao SD.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survial［J］.J Cell Mol Med，2005，9（1）：59-71.

［7］Vandemoere F，E1 Yazidi-Beiloural Adriaenssens E，et al.The antiapoptotic effect of fibroblast growth factor-2 is mediated through muclear factor B activation induced via interaction between Akt and Kinase-βinbreastcancercells［J］.Oncogence，2005，24（35）：5482-5491.

［8］Kim EC，Yun BS，Ryoo IJ，et al.Complestatin prevents apoptotic cell death：inhibitionofamitochondrial caspasepathwaythrough AKT/PKB activation［J］.BiochemBiophysResCommun，2004，313（1）：193-204.