臭豆堿在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)和組織分布

達(dá)林其木格 內(nèi)蒙古呼和浩特職業(yè)學(xué)院 010050

李培鋒 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與科學(xué)院 010018

關(guān) 紅 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與科學(xué)院 010018

臭豆堿（Anagyrine，Ana）為黃色油狀液體，難溶于石油醚，可溶于乙醚和苯，易溶于氯仿、乙醇和水。為順式并聯(lián)的喹諾里西啶，分子式為C15H20N2O，是黃華堿的立體異構(gòu)體[1]。在黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bunge）、甘肅棘豆（Oxytropis kansuensis）和小花棘豆（Oxytropis glabra）等多種毒草以及披針葉黃華和苦參中均含有臭豆堿[2、3]，其中在小花棘豆中含量較高，是主要有毒生物堿之一[4]。這些毒草廣泛分布在中國(guó)西北地區(qū)的天然牧場(chǎng)，對(duì)當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)造成了非常嚴(yán)重的危害。國(guó)外學(xué)者研究證明，臭豆堿對(duì)較高等的動(dòng)物有致畸作用，如引起家畜畸形、腭裂、腿和脊柱變形等，亦可導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)。此外，臭豆堿還具有促進(jìn)分娩、治療痛經(jīng)等作用[5～7]。20世紀(jì)70年代末日本學(xué)者太田長(zhǎng)世等曾用氨基柱成功地分離和測(cè)定了中藥苦參中的臭豆堿含量[8]。筆者創(chuàng)立了臭豆堿在大鼠血漿中的用反相離子對(duì)高效液相色譜法[9]，此法亦適用于檢測(cè)臭豆堿在大鼠肝、腎、腦組中的濃度，以探明臭豆堿在動(dòng)物體內(nèi)毒動(dòng)學(xué)及組織分布情況提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，體重190±10g，雌雄各半。

1.2 藥品與試劑

臭豆堿粗提物（寧夏測(cè)量中心提供，臭豆堿含量 37.87%）。

臭豆堿純品 （對(duì)臭豆堿粗提物經(jīng)過分離純化、重結(jié)晶所得，用HPLC面積歸一化法測(cè)定臭豆堿，含量不低于99%）十二烷基磺酸鈉（SDS）為HPLC專用，磷酸、三乙胺（重蒸）、三氯甲烷、異丙醇、氨水為分析純，乙腈為色譜純，水為附院自制重蒸餾水。臭豆堿純品儲(chǔ)備液（1mg/mL）：精密稱取臭豆堿純品25mg溶于25.0mL甲醇中，置-4℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 儀器

日本島津LC-10A高效液相色譜系統(tǒng)，包括LC-10AT泵、SPD-10A此外檢測(cè)器、CTO-10A柱溫箱、SCL-10A系統(tǒng)控制器、CR-7Ae數(shù)據(jù)處理器、DUG-12A在線脫氣泵，F(xiàn)ZQ-2型旋渦混合器，LN-9527-01 型高速離心機(jī) （10000r/min），SFO-01B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.4 分組給藥與采樣

Wistar大鼠105只，隨機(jī)分成15組,每組7只，按6.82mg/kgobow單劑量灌胃臭豆堿。灌胃前夜禁食 12 小時(shí)，自由飲水，按時(shí)序（0.5、1.5、2.5、5、10、20、40、60、90、120、240、360、480、600、720min）分別采集各組大鼠的血漿、肝臟、腎臟和腦組織。

1.5 血樣處理與測(cè)定

精密吸取血漿樣品1.0mL，置10mL試管中，精確加入25%氨水200μL充分混勻，加3.0mL三氯甲烷旋渦混合提取5min，離心(5000r/min)5min,分取有機(jī)相，在65℃水浴中空氣吹干，將殘留物準(zhǔn)確用 500μL 甲醇溶解,離心 (10000r·min-1)2min，取25μL進(jìn)樣分析，空白血漿及血漿樣品色譜圖見圖1。

1.6 組織樣品處理

稱取腎組織約1g,精密稱定,精確加入25%氨水50uL，再加3.0mL三氯甲烷,用組織勻漿機(jī)搗碎3min,有機(jī)相全部轉(zhuǎn)入10mL離心管(5000r/min)15min,分取有機(jī)相,在65℃烘箱中空氣吹干,將殘留物準(zhǔn)確用500uL甲醇溶解,離心(10000r/min)2min,取25uL進(jìn)樣分析，空白組織及組織樣品色譜圖見圖1。

1.7 色譜條件

色譜柱為大連產(chǎn) HYP-ODS柱 （200mm×4.6mm）,柱溫30℃；流動(dòng)相由水相-異丙醇-乙腈（150：15：20體積比）組成。水相部分每 1000mL 中含SDS 0.5g,三乙胺3.5mL,85%磷酸2mL(用三乙胺調(diào)至PH 3.0)；流速 1.0mL.min-1紫外檢測(cè)波長(zhǎng)309nm。

1.8 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取大鼠空白血漿1.0mL,共 7份，置7支10 mL離心管中，定量加入臭豆堿純品儲(chǔ)備液，使其濃度分別為 60、120、250、500、1000、1500、2000μg·L-1，按“1.5”項(xiàng)下方法操作，以被測(cè)物峰面積Y對(duì)濃度X(μg·L-1)進(jìn)行線性回歸得回歸方程：Y=166.76x-1369.3 r=0.9993以信噪比 S/N=3為標(biāo)準(zhǔn)，本方法的最低檢測(cè)濃度為10μg·L-1。

1.9 組織體外標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用臭豆堿儲(chǔ)備液分別配成 50、120、250、500、1000ng/mL 和 1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000ng/mL兩種濃度梯度。以被測(cè)物峰面積Y對(duì)濃度X(μg/L)進(jìn)行線性回歸得回歸方程分別為：低濃度為Y=86.458X+286.6，R2=0.9999； 高濃度為 ：Y=85.719X+21686 R2=0.9988。

2 結(jié)果

2.1 臭豆堿的色譜行為

在上述的色譜條件下,基線走動(dòng)平穩(wěn)?？瞻籽獫{、肝﹑腎﹑腦組織雜峰少,對(duì)臭豆堿峰無干擾。樣品中臭豆堿與前面未知物峰達(dá)到了基線分離。經(jīng)HPLC分析后，所得結(jié)果見表1。

2.2 臭豆堿的藥時(shí)曲線圖

大鼠灌服臭豆堿6.82mg/kg后,血、肝、腦和腎組織中的濃度見表1；平均毒物濃度-時(shí)間曲線見圖2。

表1：大鼠灌服臭豆堿6.82mg/kg后血漿、肝、腦和腎組織中的濃度(n=7,±SD)

表1：大鼠灌服臭豆堿6.82mg/kg后血漿、肝、腦和腎組織中的濃度(n=7,±SD)

2.3 動(dòng)學(xué)參藥數(shù)

經(jīng)DAS ver1.0藥動(dòng)學(xué)軟件處理,選定血漿﹑肝﹑腎和腦組織液的最佳藥代動(dòng)學(xué)模型為一級(jí)吸收一室開放模型，主要參數(shù)見表2。

表2：口服臭豆堿在大鼠血漿、肝、腎和腦組織內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

3 討論

（1）血漿與肝、腎、腦組織藥物濃度經(jīng)DAS ver1.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，臭豆堿在大鼠體內(nèi)與組織的動(dòng)力學(xué)特性均可用一級(jí)吸收的一室開放模式去擬合，根據(jù)所獲得的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知，吸收半衰期長(zhǎng)短順序?yàn)椋耗X組織﹥腎臟﹥血漿﹥肝臟，其中在肝組織中吸收半衰期為0，這表明臭豆堿進(jìn)入胃內(nèi)后可被迅速吸收，分布到肝、腎、腦組織；消除半衰期均在2.4小時(shí)內(nèi)，其長(zhǎng)短順序?yàn)椋耗X組織﹥血漿﹥肝臟﹥腎臟，而其差相異構(gòu)體-黃華堿的的消除半衰期則為121.3小時(shí) [10]；達(dá)峰時(shí)間長(zhǎng)短順序?yàn)椋耗I臟﹥血漿﹥腦組織﹥肝臟，其中在肝臟的達(dá)峰時(shí)間僅為2.5min；峰濃度大小順序?yàn)椋耗I臟﹥肝臟﹥腦組織﹥血漿。說明臭豆堿灌服后具有吸收快、分布迅速、消除快、蓄積時(shí)間短的特點(diǎn)。

（2）臭豆堿的肝腎平均濃度是腦組織平均濃度的10倍和13倍。臭豆堿的血液濃度很低，其平均峰濃度不到1mg/L，這和黃華堿的結(jié)果基本一致[10]。胃中的食糜對(duì)臭豆堿的吸收有很大的影響，給藥后完全禁食禁水狀態(tài)下8小時(shí)后血液中基本測(cè)不到臭豆堿，但不禁食狀態(tài)下12小時(shí)后血液濃度仍然還能測(cè)出。本實(shí)驗(yàn)是完全禁食禁水狀態(tài)下進(jìn)行的。

（3）臭豆堿是小花棘豆的主要有毒生物堿之一。小花棘豆中毒表現(xiàn)為以廣泛的空泡變性為主的全身性退行性變化，其中肝臟首先受到損傷，而腎臟、腦組織的損傷遲于肝臟。臭豆堿在肝、腎、腦組織均有很高的分布，且平均濃度比血漿高，臭豆堿的這一毒代動(dòng)力及組織分布特點(diǎn)與小花棘豆中毒后的損傷規(guī)律是一致的。

[1]孟協(xié)中.胡向群等，黃花棘豆毒性生物堿的鑒定.寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1994，15（2）：67～70.

[2]孟協(xié)中.胡向群等，寧夏兩種有毒棘豆中毒性成分的研究.寧夏農(nóng)林科技，1994,2:37-40.

[3]孟協(xié)中.張如明甘肅棘豆中有毒生物堿的研究，草業(yè)學(xué)報(bào)，4(1):6-8

[4]史志誠(chéng).中國(guó)草地重要有毒植物，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996，45～65.

[5]Makal W,]Keller W J.Alkaloid distribution in two species of bupinus in central British Columbia.Phytochemisty.1994,36:4,883-885.

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[8]Nagayo Ota,YoshikiMino.Pharmacognostical Studies on the Chinese Crude Drug"Sophorae Radix" (I) High-Speed Liquid Chromatographic Studies on the Alkaloid Constituents of "Sophorae Radix".Shoyakugaku Zasshi.1979,33(3),140-145.

[9]李培鋒、達(dá)林其木格等，臭豆堿在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)研究，毒理學(xué)雜志，2008,22（3）：204-206.

[10]李守軍、李祚煌、楊桂云.小花棘豆中[3H]黃花堿的毒代動(dòng)力學(xué)及體內(nèi)分布，動(dòng)物毒物學(xué)，1991，（6卷）1 期：3-7.