腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原學(xué)研究及其對(duì)藥材質(zhì)量的影響

蔣 妮， 唐美瓊， 藍(lán)祖栽， 黃永才， 林 楊， 白隆華

（廣西藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530023）

腫節(jié)風(fēng)［Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai]又名草珊瑚、九節(jié)茶，為金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬（Sarcandra）多年生草本植物，以全草入藥，具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，為中國(guó)藥典收錄品種［1]，同時(shí)也是廣西瑤族地區(qū)民間流傳的“七十二風(fēng)”傳統(tǒng)瑤藥中的重要品種［2]。近年來(lái)，隨著腫節(jié)風(fēng)產(chǎn)品的不斷開發(fā)，腫節(jié)風(fēng)藥材資源日益緊俏，為此，廣西藥用植物園在廣西融安、東蘭等地開展了腫節(jié)風(fēng)的規(guī)范化栽培研究工作，并在南寧建立腫節(jié)風(fēng)種質(zhì)資源圃。在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)植株地上部分受病害危害較為嚴(yán)重，主要在葉片上表現(xiàn)出褐色枯斑，引起葉片大量枯萎。目前關(guān)于腫節(jié)風(fēng)葉斑類病害國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，為此，筆者在腫節(jié)風(fēng)種質(zhì)資源圃對(duì)該病害的發(fā)生情況進(jìn)行定期調(diào)查，并進(jìn)行病原分離鑒定及生物學(xué)特性研究，以期為病害的識(shí)別及防治提供理論依據(jù)。

目前，關(guān)于藥用植物病害與藥材質(zhì)量的關(guān)系研究報(bào)道很少。王喜軍報(bào)道龍膽斑枯病不但會(huì)造成產(chǎn)量損失，同時(shí)也會(huì)使藥材質(zhì)量變劣，有效成分含量下降［3]。高微微等［4]研究根部病害對(duì)西洋參根不同部位主要皂苷含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)生根病的西洋參根中人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量之和低于正常參根；其中Rb1受根病的影響最為明顯，隨著病害程度加重而顯著下降。據(jù)田間調(diào)查，腫節(jié)風(fēng)炭疽病可危害植株葉、葉柄及莖，由于腫節(jié)風(fēng)全株入藥，生產(chǎn)中感病的藥材通常也被采收入藥。研究腫節(jié)風(fēng)炭疽病不同病情對(duì)腫節(jié)風(fēng)產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，正確評(píng)價(jià)該病害對(duì)腫節(jié)風(fēng)生產(chǎn)造成的影響，不僅利于制定防治指標(biāo)，做出正確防治決策，而且對(duì)于腫節(jié)風(fēng)藥材的質(zhì)量控制具有重要的參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 腫節(jié)風(fēng)炭疽病田間發(fā)生情況調(diào)查

2008年在南寧廣西藥用植物園腫節(jié)風(fēng)種質(zhì)圃進(jìn)行調(diào)查，每月下旬調(diào)查1次。采取隨機(jī)取樣，調(diào)查20株，每株上、中、下各查10片葉，共查600片葉。分級(jí)調(diào)查，統(tǒng)計(jì)病害發(fā)生率和病情指數(shù)。

參考謝玲等［5]方法制定腫節(jié)風(fēng)炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

0級(jí)：葉片無(wú)病斑；

1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的10%以下；

2級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的10%～29%；

3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的30%～50%；

4級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的50%以上。

病情指數(shù)＝∑（病級(jí)葉片數(shù)×代表數(shù)值）／（調(diào)查葉片總數(shù)×發(fā)病最重級(jí)別的代表數(shù)值）×100。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 菌株分離

采摘新感病的腫節(jié)風(fēng)病葉，常規(guī)組織分離法分離，將分離到的菌株單孢純化后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定

采取針刺菌片接種方法接種葉片，以接種PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，在室溫（20～25℃）下保濕培養(yǎng)5d，記錄發(fā)病情況，對(duì)比發(fā)病后癥狀并再分離病原作柯赫氏驗(yàn)證［6]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將致病菌株移至PDA平板上28℃下進(jìn)行培養(yǎng)，按玻片培養(yǎng)法觀察和記載病菌的形態(tài)特征［6]，結(jié)合菌落形態(tài)、病害的癥狀，參考魏景超［7]《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行病原菌種屬鑒定。

1.2.4 分子鑒定

采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA［8]。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成），擴(kuò)增該菌的rDNA－ITS序列。擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和序列測(cè)定委托北京諾賽生物科技有限公司進(jìn)行，所得到的核苷酸序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較［9]。

1.3 生物學(xué)特性測(cè)定［6]

1.3.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

將病原菌接種于PDA平板上，分別在6、12、18、24、26、28、30、35℃和40℃下培養(yǎng)4d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑；培養(yǎng)7d后在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10mL無(wú)菌水，用毛筆將孢子刷下，紗布過(guò)濾后用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，計(jì)算產(chǎn)孢量［10]；每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

用0.5%葡萄糖液配制分生孢子懸浮液（濃度為低倍鏡下每個(gè)視野30～50個(gè)分生孢子），分別在上述不同溫度下培養(yǎng)12h，鏡檢300個(gè)孢子的萌發(fā)情況，孢子的萌發(fā)以芽管的長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑的一半為標(biāo)準(zhǔn)（下同），統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

分生孢子萌發(fā)率＝（萌發(fā)孢子總數(shù)／300）×100%。

1.3.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

將病原菌接種于pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA平板上，28℃下培養(yǎng)4d，測(cè)量菌落直徑和產(chǎn)孢量（方法同1.3.1）；配制孢子懸浮液（方法同1.3.1），并調(diào)成上述不同的pH，28℃下培養(yǎng)12h，鏡檢萌發(fā)情況。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

將直徑為6mm的菌碟移入PDA平板，分別采用連續(xù)光照、完全黑暗和12h光暗交替3種條件，于28℃下培養(yǎng)，4d后測(cè)菌落直徑，7d后測(cè)產(chǎn)孢量。每處理重復(fù)3次。

1.4 罹病腫節(jié)風(fēng)植株中異嗪皮啶含量測(cè)定［1]

1.4.1 樣品及試劑

試驗(yàn)所用腫節(jié)風(fēng)均采自廣西藥用植物園腫節(jié)風(fēng)種質(zhì)圃，將不同病情指數(shù)的腫節(jié)風(fēng)編號(hào)分類后，經(jīng)自然干燥，備用，不感病植株作對(duì)照。試驗(yàn)所用的異嗪皮啶對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)：110837－200304）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純。

1.4.2 主要儀器

VARIAN210型高效色譜儀。

1.4.3 供試品的制備

取腫節(jié)風(fēng)藥材樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩），精密稱取1g粉末，置具橡膠塞的圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密閉塞緊，稱定重量，加熱回流1h放冷，再稱定重量。用甲醇補(bǔ)足減少的重量。用微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.4.4 色譜條件

精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，參照《中國(guó)藥典》（2010）腫節(jié)風(fēng)含量測(cè)定方法測(cè)定，即得。色譜條件為：色譜柱Sun－FireTM－C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈—0.1%磷酸溶液（20：80）；流速1.0mL／min；溫度30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)342nm。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

依次吸取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL 標(biāo)準(zhǔn)液注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y＝129.96x－29.338，R＝0.999 9，進(jìn)樣量在0.102～0.605μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.6 對(duì)照品溶液的制備

稱取異嗪皮啶對(duì)照品1.97mg，加入定量甲醇稀釋，吸取定量稀釋液用10mL容量瓶定容，加入定量甲醇稀釋，配成10μg／mL的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果和分析

2.1 病害調(diào)查

田間癥狀主要表現(xiàn)在植物葉片上（圖1a）。發(fā)病初期在葉片上呈現(xiàn)圓形、橢圓形紅褐色小斑點(diǎn)，后期擴(kuò)展成深褐色圓形病斑，中央則由灰褐色轉(zhuǎn)為灰白色，病斑邊緣有黃色暈圈，最后病斑轉(zhuǎn)為黑褐色，并產(chǎn)生輪紋狀排列的小黑點(diǎn)。嚴(yán)重時(shí)一個(gè)葉片上有十多個(gè)至數(shù)十個(gè)病斑，后期病斑穿孔，病斑多時(shí)融合成片導(dǎo)致葉片干枯。病原菌也可侵染葉柄、莖部，通常會(huì)出現(xiàn)圓形或近圓形的病斑，呈淡褐色，其上生有輪紋狀排列的黑色小點(diǎn)，后期病斑部縊縮，葉柄或莖折斷。莖部染?。▓D1b），可產(chǎn)生與葉片上相似的癥狀，但多從葉腋處先發(fā)生，并向新生枝及主莖擴(kuò)展，造成病部變褐，凹陷，病斑多為圓筒形或長(zhǎng)橢圓形。嚴(yán)重時(shí)，病斑可以布滿莖表，并可串連成片，使莖的表皮呈黑褐色，嚴(yán)重影響?zhàn)B分的運(yùn)輸，造成植株生長(zhǎng)衰弱，部分病株枯死。

圖1 腫節(jié)風(fēng)炭疽病癥狀

田間病情調(diào)查結(jié)果表明腫節(jié)風(fēng)炭疽病在南寧周年均有發(fā)生（圖2）。1－5月及11－12月的病情指數(shù)相對(duì)較低，均小于30；5－9月份隨著溫度的升高及降水的增加，病情指數(shù)不斷升高，8、9月的病情指數(shù)達(dá)到高峰，分別為61.06和54.78。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)老葉多從4月初開始發(fā)病，5－6月迅速發(fā)展，新葉則多從8月開始發(fā)病。病菌以菌絲體、分生孢子或分生孢子盤在寄主殘?bào)w或土壤中越冬，分生孢子靠風(fēng)雨、澆水等傳播。田間栽植過(guò)密、通風(fēng)不良、葉子相互交叉更容易感病。

圖2 腫節(jié)風(fēng)炭疽病田間周年發(fā)生情況

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 致病性測(cè)定

接種葉片在室溫下保濕培養(yǎng)5d后，針刺接種的葉片表現(xiàn)出與自然發(fā)生的葉枯病相似的癥狀（圖1c），病斑初為斑點(diǎn)狀，逐漸擴(kuò)展成圓形或橢圓形大斑，深褐色，且由于溫濕度條件好，生長(zhǎng)旺盛，7d后病斑迅速蔓延至葉緣，從發(fā)病葉片上再分離的病菌與原接種菌株相同，證實(shí)了原接種菌株為致病菌，傷口為該菌對(duì)寄主成功侵染的前提條件之一。以同樣的方法得到病葉柄的致病菌，經(jīng)鑒定與葉片致病菌為同一菌。

2.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣整齊，初為淺灰白色，后轉(zhuǎn)深煙灰色至黑褐色，培養(yǎng)皿反面，菌落以接種點(diǎn)為中心，呈數(shù)圈黑褐色同心輪紋。菌絲體白色，氣生菌絲平鋪，絨毛狀，后期菌落中央形成土紅色黏稠孢子團(tuán)。分生孢子盤黑褐色，褥座狀，有剛毛，頂端稍尖、黑褐色，有分隔。分生孢子新月形、單孢、無(wú)色，基部稍鈍，頂端稍尖，內(nèi)含1個(gè)油球，大小為（18.5～25.8）μm× （3.0～4.2）μm，附著胞（10.2～13.6）μm×（6.8～8.6）μm，深褐色，不規(guī)則三角形。據(jù)上述特征初步鑒定該種病原菌為炭疽屬真菌（Colletotrichumsp.）。

2.2.3 病原菌的rDNA—ITS序列分析

采用通用引物ITS4／ITS5對(duì)菌株的rDNA—ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約為600bp的片段，經(jīng)序列測(cè)定，該片段全長(zhǎng)554bp（圖3）。將上述測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性分析，該病原菌株與Colletotrichum dematium的同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)鑒定確定該病原菌為黑線炭疽菌（Colletotrichum dematium）。

圖3 菌株ITS－rDNA片段序列

2.3 菌株生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

黑線炭疽菌在6～35℃均能夠生長(zhǎng)，12～35℃生長(zhǎng)良好，適宜生長(zhǎng)溫度為26～28℃，40℃菌絲停止生長(zhǎng)，不產(chǎn)孢子。

2.3.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

表2試驗(yàn)結(jié)果表明：黑線炭疽菌的菌絲體在弱酸、弱堿和中性條件下生長(zhǎng)良好，隨著酸堿度的增加，菌絲體的生長(zhǎng)活性逐漸降低；pH為5時(shí)產(chǎn)孢量最大；pH為11時(shí)產(chǎn)孢量最??；黑線炭疽菌在中性或近中性條件下孢子萌發(fā)率最高，隨著酸度或堿度的增加，孢子萌發(fā)率逐漸降低，在pH為7時(shí)黑線炭疽菌的孢子萌發(fā)率達(dá)最大值，pH為3時(shí)孢子萌發(fā)率均為最小值。

2.3.3 光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果如表3所示，黑線炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢對(duì)光均不敏感，在所有的光環(huán)境下均保持較好的長(zhǎng)勢(shì)，差異不顯著。在黑暗環(huán)境下的孢子萌發(fā)率較低，說(shuō)明光照有利于孢子萌發(fā)。

表3 光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響1）

2.4 罹病腫節(jié)風(fēng)的藥材質(zhì)量

表4結(jié)果顯示：輕微感病（病情指數(shù)＜10）的腫節(jié)風(fēng)藥材，異嗪皮啶含量與健康植株含量相同，藥材質(zhì)量未受影響；病情指數(shù)＞10的腫節(jié)風(fēng)藥材，與健康植株相比異嗪皮啶含量均有所減少；除了病情指數(shù)為30～40范圍的腫節(jié)風(fēng)藥材，其他感病藥材的異嗪皮啶含量都隨著病情的加重而降低；當(dāng)病情指數(shù)增加到60～70，異嗪皮啶含量顯著低于健康植株，且在病指數(shù)達(dá)90～100，異嗪皮啶含量為0.019 6%，低于藥典要求（不得少于0.020%）?？梢姡∏橹笖?shù)范圍60～70，是異嗪皮啶含量的臨界期，大于此臨界值，對(duì)藥材質(zhì)量影響較大。

表4 腫節(jié)風(fēng)炭疽病不同病情指數(shù)異嗪皮啶含量及植株鮮重

隨著病情的發(fā)展，腫節(jié)風(fēng)炭疽病所造成的產(chǎn)量損失逐漸增加。病害發(fā)生初期（病情指數(shù)＜50），病害對(duì)產(chǎn)量所造成的損失較小，植株鮮重減少3.04%～6.44%；病情指數(shù)50～60時(shí)，病害所造成的損失顯著增加，植株鮮重減少了34.56%，當(dāng)病情指數(shù)＞90，大部分葉片及莖干均干枯，植株鮮重減少至62.32%?？梢姡∏橹笖?shù)范圍在50～60，植物鮮重為一個(gè)臨界期，大于此范圍的發(fā)病情況會(huì)對(duì)藥材產(chǎn)量影響較大。

綜合考慮藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，建議病情指數(shù)50～60，就需開始進(jìn)行病害的防治工作。

3 結(jié)論與討論

炭疽病是植物常見病害，多為炭疽菌屬真菌引起［11]，現(xiàn) 有 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 黑 線 炭 疽 菌 （Colletotrichum dematium）的寄主僅有麥冬、銀邊沿階草等植物［12－13]。腫節(jié)風(fēng)是黑線炭疽菌的新記錄寄主。

黑線炭疽菌最適宜的生長(zhǎng)溫度為26～28℃；35℃下菌絲正常生長(zhǎng)，但不能產(chǎn)孢，40℃時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)，表明高溫可抑制孢子的形成；中性或弱酸、弱堿條件適宜該菌菌絲的生長(zhǎng)，孢子的產(chǎn)生及萌發(fā)；光照對(duì)菌絲的生長(zhǎng)、孢子的產(chǎn)生無(wú)明顯影響，而對(duì)孢子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。以上結(jié)果與前人報(bào)道基本一致［12－13]。炭疽菌主要以分生孢子盤、菌絲、分生孢子在土壤、病殘枝上越冬，以分生孢子完成初侵染和再侵染［14]。要有效進(jìn)行防治，還需以其生物學(xué)特性為基礎(chǔ)，結(jié)合環(huán)境因子、耕作條件等綜合因素，掌握其侵染及流行規(guī)律，從而制定包括農(nóng)事特別是輪作、化學(xué)等生態(tài)調(diào)控的技術(shù)措施。

植物病害會(huì)影響藥材產(chǎn)量和質(zhì)量［15－16]。本研究結(jié)果得出相似的結(jié)論：（1）腫節(jié)風(fēng)炭疽病會(huì)造成產(chǎn)量損失，隨著病情的加重，植株鮮重減少。分析原因是由于病害加重，葉片枯死，從而影響了光合作用，減少了有機(jī)物的積累，使產(chǎn)量下降，而這種下降在病情較輕和病害發(fā)生初期并不明顯，只有到病情特別嚴(yán)重時(shí)才表現(xiàn)較為明顯。（2）感病腫節(jié)風(fēng)的有效成分含量隨病情不同而有一定變化。病情指數(shù)＞10，有效成分含量均低于健康植株，總體上隨著病情的加重，有效成分含量逐漸減低。病情指數(shù)大于50的植株，不適宜入藥。

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